甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统 及其重组表达蛋白的应用。
【背景技术】
[0002] 伤寒和副伤寒是由沙门菌属伤寒杆菌（Salmonella typhi)、甲型副伤寒沙门菌 (Salmonella paratyphi A)、肖氏沙门菌（Salmonella schottmueller)感染，偶由希氏沙 门菌（Salmonella hirschfeldii)感染引起的常见人类急性传染病。每年全球伤寒或副伤 寒病例数高达2000万左右，死亡病例超过20万以上。伤寒或副伤寒也是我国常见的法定 乙类传染病之一，每年发病率均位于所有乙类传染病前5位，故是我国重点监控并进行计 划免疫的传染病之一。
[0003] 接种疫苗是预防和控制传染病的根本措施，对于控制无症状及恢复期带菌者较 多、耐药率较高的伤寒或副伤寒，接种疫苗尤为必要。早年用于预防接种的伤寒、甲型副伤 寒和乙型副伤寒三联全菌死疫苗，因其免疫保护率低(约50%)、有效免疫力维持时间较短， 尤其是副作用很大，仅中、强不良反应即高达8. 6%，我国早已停止使用该疫苗进行预防接 种。伤寒杆菌具有化学成分为聚-N-乙酸-D-半乳糖胺糖醛酸的荚膜多糖，因其与细菌毒 力密切相关且有较强抗原性，故称之为毒力抗原（virulentantigen,Vi-Ag)。上世纪90年 代中期，以伤寒杆菌荚膜多糖作为抗原的疫苗在中国、法国、墨西哥研制成功并上市，称之 为Vi疫苗。Vi疫苗安全、不良反应小、保护效果好(约75%)且抗体维持时间长，现已代替 三联全菌死疫苗用于免疫接种。细菌学上早已明确，伤寒杆菌、肖氏沙门菌和希氏沙门菌有 Vi抗原，但甲型副伤寒沙门菌无Vi抗原。因此，Vi疫苗不仅不能防控甲型副伤寒沙门菌感 染，其免疫筛选作用有可能导致甲型副伤寒沙门菌流行。研究并明确甲型副伤寒沙门菌表 面保护性抗原，研发具有预防甲型副伤寒沙门菌感染的疫苗具有重要的医学意义。
[0004] 革兰阴性菌具有外膜及外膜蛋白（outermembraneproteins,0MP)，外膜蛋白是 革兰阴性菌重要的表面抗原成分，沙门菌也不例外。然而，传统生化方法提取细菌蛋白抗原 普遍存在产量及得率低、不同批次差异大等问题，难以用于疫苗生产，采用基因工程技术表 达外膜蛋白抗原分子、制备基于重组外膜蛋白抗原的基因工程疫苗可能是研发甲型副伤寒 沙门菌疫苗的唯一有效途径。
[0005] 2004年McClelland等报道了甲型副伤寒沙门菌全基因序列，其中至少有21个 0MP编码基因（GenBank accession No. : CP000026)。我们以往研究证实，甲型副伤寒沙门 菌SpaO、OmpA和NmpC有免疫保护作用，但其余0MP免疫原性和免疫保护作用未有研究报 道。病毒仅有一种或数种表面蛋白抗原，故采用单一的病毒主要表面蛋白抗原制备的基因 工程疫苗即可获得良好的免疫保护效果。细菌是原核细胞型微生物，表面抗原复杂多样，采 用单一蛋白抗原往往不易获得令人满意的免疫保效果，这可能是采用单一重组蛋白抗原基 因工程疫苗免疫效果不佳的主要原因，采用多种蛋白抗原制备的多价基因工程疫苗有可能 获得较为理想的免疫保护效果。因此，除SpaO、OmpA和NmpC外，研究其他甲型副伤寒沙门 菌0MP免疫原性和免疫保护效果，以便从中筛选出若干种分布广泛、序列保守、抗原性和免 疫保护作用较强的0MP抗原，可为研制多价甲型副伤寒沙门菌基因工程疫苗奠定基础。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供甲型副伤寒沙门菌ompN 基因原核表达系统及其重组表达蛋白的应用的技术方案。
[0007] 所述的甲型副伤寒沙门菌因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
[0008] 所述的甲型副伤寒沙门菌〇呢《因的重组表达蛋白，其特征在于该表达蛋白的 氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0009] 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白在对甲型副伤寒杆菌的免疫 保护中的应用。
[0010] 所述的甲型副伤寒沙门菌ompN基因的重组表达蛋白在制备治疗甲型副伤寒疫苗 中的应用。
[0011] 所述的含有权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌因的重组表达载体。 [0012] 所述的甲型副伤寒沙门菌因的重组表达载体的构建方法，其特征在于包 括以下步骤： 1) 〇?/?7\基因扩增，得到基因； 2) 采用T-A克隆试剂盒将堪因克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-T 3) 将pMD-19-T_#与原核表达载体pET42a用NdeI和XbaI双酶切，回收目的DNA条 带，将300?500ng的提纯的DNA条带与100ng线性化pET42a混合，在T4DNA连接酶作 用下形成重组表达载体pET42aMP#。
[0013] 所述的甲型副伤寒沙门菌因的重组表达载体的构建方法，其特征在于所 述的步骤1)中以甲型副伤寒沙门菌基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQIDN0 :3所 示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示的下游引物进行PCR扩增。
[0014] 所述的含有权利要求1所述的甲型副伤寒沙门菌因的重组表达工程菌。
[0015] 所述的甲型副伤寒沙门菌因的重组表达工程菌构建方法，其特征在于包 括以下步骤： 1) 〇?/?7\基因扩增，得到基因； 2) 采用T-A克隆试剂盒将堪因克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-T 3) 将pMD-19-T_#与原核表达载体pET42a用NdeI和XbaI双酶切，回收目的DNA条 带，将300?500ng的提纯的DNA条带与100ng线性化pET42a混合，在T4DNA连接酶作 用下形成重组表达载体pET42aMP#; 4) 采用CaCl2法将pET42a 转化入表达宿主菌万.co/iBL21DE3形成工程菌株五 BL21DE3-。
[0016] 所述的甲型副伤寒沙门菌因的重组表达工程菌构建方法，其特征在于所 述的步骤1)中以甲型副伤寒沙门菌基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQIDN0 :3所 示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDN0 :4所示的下游引物进行PCR扩增。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 1.甲型副伤寒沙门菌临床菌株ompN基因PCR扩增及纯化产物测序结果表明，该基因分 布于所有临床菌株，其编码的外膜蛋白序列保守，可以作为细菌基因工程疫苗的候选抗原。
[0018] 2.膜定位显示OmpN定位于甲型副伤寒沙门菌表面。OmpN表达于细菌表面是可以 作为细菌基因工程疫苗的候选抗原的必要条件。
[0019] 3.利用大肠杆菌为表达宿主菌，其结构简单、生长速度快的特点，易于培养和发 酵、培养工程工程提取重组表达外膜蛋白rOmpN产量高、有效降低了生产成本，且表达条件 习易于标准化适用于规模化生产。
[0020] 4.动物实验结果提示重组膜蛋白rOmpN具有良好的免疫原性，后期保护试验证实 该蛋白质具有良好的免疫保护能力。
【附图说明】
[0021] 图1为甲型副伤寒沙门菌ompN基因PCR检测结果； 图中：泳道M:DNAmarker;泳道1 :空白对照；泳道2?6 :分别为甲型副伤寒沙门菌 50001参考标准株和4株甲型副伤寒沙门菌临床代表株ompN基因扩增条带。
[0022] 图2为甲型副伤寒沙门菌rOmpN表达及提取效果； 图中：泳道M:蛋白marker;泳道1 :野生型pET42a空白对照；泳道2和3 :分别为表达 和提纯的rOmpN。
[0023] 图3为甲型副伤寒沙门菌OmpN膜结构分析结果。
[0024] 图4为甲型副伤寒沙门菌OmpN膜定位（X1500); 图中：A:r0mpN兔抗血清为一抗时OmpN膜定位；B:正常兔血清为一抗的阴性对照。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0026] 1材料和方法 1. 1菌株和血清标本来源 甲型副伤寒沙门囷参考标准株50001购自北点中国药品生物制品检定研究院。126株 甲型副伤寒沙门菌临床菌株、56份甲副伤寒病人恢复期血清分别由浙江省宁波市、温岭市 和杭州市疾病预防控制中心提供，15份微量肥达试验结果阴性的健康体检者血清由浙江省 新华医院提供。
[0027] 1. 基因扩增及测序 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen)提取上述甲型副伤寒沙门菌基因组DNA，紫 外分光光度法测定其浓度[13]。根据GenBank中甲型副伤寒沙门菌ATCC9150株基因 序列（accessionNo. :CP000026)及其限制性核酸内切酶位点分析结果，设计PCR引物并由 上海Invitrogen公司合成。上游引物(其核苷酸序列如SEQIDNO:3):CGCCATATG(Nde I)atgaaaagaaaagtattggca-3'，下游引物(其核苷酸序列如SEQIDNO:4):CGCCTC GAG(XhoI)gaactggtaaaccatacccag-3'。以 100ng甲型副伤寒沙门菌DNA为模 板，采用PCR扩增全长基因片段，反应参数：94°C5min;94°C30s、52°C30s、72°C60 s，30个循环；72°C10min。扩增产物经溴乙锭预染色的1. 5%琼脂糖凝胶电泳法检查后，采 用T-A克隆试剂盒（TaKaRa)将其克隆入pMD-19-T中形成重组