专利名称：甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光pcr检测用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲型副伤寒沙门菌的检测，具体地说，涉及甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物。
背景技术：
甲型副伤寒沙门菌(S. Paratyphi A)是肠道传染病中最常见的病原菌之一，对甲型副伤寒沙门菌的快速、准确检定是控制甲型副伤寒流行的重要手段。目前实验室常规诊断甲型副伤寒的主要方法为细菌培养、肥达氏凝集反应、伤寒血球快速诊断方法。这些方法仍存在着阳性率相对较低，诱导H-a抗原费时，不利于早期诊断等缺陷，给流行病学追踪、 早期控制及临床早期诊断工作带来一定难度，因此，有必要建立甲型副伤寒沙门菌的快速、准确的分子生物学检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物。本发明的另一目的是提供含有所述逆转录荧光PCR引物的用于检测甲型副伤寒沙门菌的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物，其包括正向引物5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3，和反向引物5’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3 ’。本发明进一步提供含有上述引物的用于检测甲型副伤寒沙门菌的试剂盒。本发明针对甲型副伤寒沙门菌hsdM基因设计特异性引物，建立检测该靶基因的逆转录荧光PCR方法，利用35个血清型的纯培养甲型副伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌RNA来评价该方法的特异性及敏感性，同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本进行检测下限确定。结果表明，利用该方法检测44株甲型副伤寒沙门菌均呈阳性，其余34种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌扩增结果均为阴性，说明该方法的特异性、敏感性均较高，达100 %。在对纯菌总RNA检测中，逆转录荧光PCR的最低检测限为5pg/反应，约为1900个拷贝/反应。在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中，最低检测限达 40cfu/mL。
图I为本发明逆转录荧光PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，I为阴性对照，2为伤寒沙门菌样品，3为乙型副伤寒沙门菌，4为丙型副伤寒沙门菌，5为鼠伤寒沙门菌，6为肠炎沙门菌，7-29为甲型副伤寒沙门菌样品，30为甲型副伤寒沙门菌阳性对照，M为DNA分子量Marker0
图2为本发明逆转录荧光PCR检测纯菌RNA扩增曲线图；其中，a h对应的模板浓度为，a :0.5 X 107pg/反应；b :0. 5 X 106pg/反应；c :0. 5 X 105pg/反应；d :0. 5 X 104pg/反应；e :0· 5 X 103pg/ 反应；f :0· 5 X 102pg/ 反应；g :0. 5 X IO1pg/ 反应；h :0. 5pg/ 反应；NC 阴性对照。图3为本发明逆转录荧光PCR检测血模拟标本扩增曲线图；其中，a为阳性对照，b g 对应的模板浓度为，b 7X 105cfu/ml ；c 7X 104cfu/ml ；d 7X 103cfu/ml ；e 7X102cfu/ml ；f :7X lOcfu/ml ；g 7X10°cfu/ml ；NC :阴性对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物的设计及检测方法I材料与方法I. I实验用菌株本实施例中使用的甲型副伤寒沙门菌44株，伤寒沙门菌、こ型和丙型副伤寒沙门菌以及其他31种非伤寒沙门菌血清型共57株(表I)，所有血清型均使用沙门菌抗血清(购自Statens Serum Institut, SSI,丹麦)进行血清型鉴定。另外，其他肠道常见病原菌及引起发热并可在血液标本中分离到的肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、立克次体、布鲁氏菌等菌株(表I)用于特异性及敏感性评价，上述菌株均来自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。I. 2引物设计根据GenBank中hsdM基因的序列设计引物4289F 5’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’ 和 4289R :5’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’，用于逆转录荧光PCR反应。I. 3血模拟标本的制备及RNA提取取新鲜培养4-6小时的甲型副伤寒沙门菌(最终菌落计数为8. OX 108cfu/ml)，进行十倍梯度系列稀释，取各稀释度菌液3. 3ml分别与同体积新鲜人抗凝血混匀，室温放置30分钟后，作为全血模拟标本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood fieldtestKit(QIAGEN公司)对上述模拟标本进行甲型副伤寒沙门菌RNA的提取，具体操作步骤严格按照说明书进行。同时以不加菌的血液作为阴性对照平行进行RNA提取。最终提取的RNA溶解到50 μ I不含RNase的无菌纯水中，取其中5 μ I作模板，进行逆转录荧光PCR反应。同时，取系列稀释菌液进行菌落计数，測定模拟标本中准确细菌含量。I. 4纯培养细菌RNA提取纯菌RNA提取使用RNeasy Minikit (QIAGEN公司)，操作步骤均严格按照说明书进行。
I. 5逆转录荧光PCR使用One Step SYBR Primerscript RT-PCR Kit II (TaKaRa)进行逆转录突光PCR反应，以提取的病原菌RNA为模板，取5 μ I加入反应体系中，两条引物各5pmol/L，使用CFX96荧光PCR仪，扩增条件为42°C 30分钟；94°C 30秒，60°C 15秒，共45个循环。绘制溶解曲线，Ct值< 35的扩增结果判定为阳性。2 结果2. I甲型副伤寒沙门菌逆转录荧光PCR的特异性及敏感性检测本实施例中一共对48种132株细菌进行了逆转录荧光PCR检测(见表I)，其中44株甲型副伤寒沙门菌均呈阳性。沙门菌属其他34种血清型扩增结果均为阴性。对其他常见腹泻病原(霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌)扩增结果亦为阴性。而且，临床其他常见发热病原菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟氏菌、立克次体、布鲁氏菌扩增结果均为阴性，表明本发明的逆转录荧光PCR引物具有较高的菌种和血清型特异性及敏感性，特异性及敏感性均达100%。逆转录荧光PCR反应后的凝胶电泳图如图I所示，阳性扩增产物大小为177bp。表I甲型副伤寒沙门菌逆转录荧光PCR特异性及敏感性检测
权利要求
1.甲型副伤寒沙门菌(SalmonellaParatyphi A)的逆转录突光PCR检测用引物,其特征在于，包括 正向引物5 ’ -CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3，和 反向引物5 ’ -GCTAAACCACCAAATTGTGT-3，。
2.含有权利要求I所述引物的用于检测甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)的试剂盒。
全文摘要
本发明提供一种甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物，其包括5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’和5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’。本发明还提供含有所述引物的用于检测甲型副伤寒沙门菌的试剂盒。本发明是针对甲型副伤寒沙门菌hsdM基因设计的特异性引物，用于检测该靶基因的逆转录荧光PCR反应中，利用该方法检测44株甲型副伤寒沙门菌均呈阳性，其余34种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌扩增结果均为阴性，说明该方法的特异性、敏感性均较高，逆转录荧光PCR的最低检测限为5pg/反应。
文档编号C12Q1/68GK102634577SQ20121008368
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者樊粉霞, 闫梅英, 阚飙 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所