专利名称：沙门菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明针对肠道病原菌中沙门菌属(包括伤寒、副伤寒和非伤寒、副伤寒沙门菌)的同步分离和鉴定方法，特别涉及利用多种选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定包括伤寒、副伤寒和非伤寒、副伤寒沙门菌在内的所有沙门菌(血清型)的试剂盒、制备和应用。
背景技术：
沙门菌目前已经明确的分类包括2个模式种，6个亚种，近2500个血清型，和人类有关系的主要为伤寒、副伤寒和非伤寒、副伤寒沙门菌(多属于亚种I )，由于伤寒和副伤寒沙门菌的致病特征、生物学性状与大多数的非伤寒、副伤寒沙门菌存在较大的差异，造成许多实验室在实际工作中无法通过一种简单的微生物常规分离方法达到同时分离所有沙门 菌病原(血清型)的预期效果，反而受制于所用培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低以及多次对疑似菌落筛选和鉴定所用自动化生化反应试剂材料带来的昂贵费用，既费工又费时；其次，从不同技术属性和分工的实验室能力要求角度考量，存在对沙门菌(即包括伤寒、副伤寒和非伤寒、副伤寒沙门菌)有着不同侧重、兼而有之的技术要求和方法的敏感性要求。中国专利申请201010550372. 3公开了 “沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用”，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行分离、检测和鉴定的程序，可应用于食品和其它粪便类样品中沙门菌和志贺菌的同步检测。但是该方法筛选病原菌的检测流程还存在一定局限性，无法满足不同类型实验室的专业实验室的特殊的技术要求；在处理不同类型的标本上没有使实验室的材料与方法的绩效比达到预期效果。
发明内容
本发明目的是提供一种一次可同步分离伤寒和非伤寒沙门菌的试剂盒、制备和应用。主要解决现有沙门菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明针对不同性质实验室(临床实验室和公共卫生实验室)需求对不同类型标本分别使用I种或2种不同选择性增菌液及2种可选择的专一性分离平板配合简单的糖生化发酵反应模式和细菌特异性酶-底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对伤寒、副伤寒和(或)非伤寒、副伤寒沙门菌同步筛选分离和简易鉴定的效果，反之，若单纯仅需分离非伤寒、副伤寒沙门菌的实验室可根据推荐针的分离程序产生的绩效比更好。本发明的技术方案为沙门菌分离、鉴定的试剂盒，包括
I、通用型非选择性增菌液胰酪胨大豆胨肉汤(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. 0g, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水1000ml,加热溶解后矫正pH至7.3±0.2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅压力15分钟(121°C )灭菌后分装225mL/瓶备用。2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液胰酪胨大豆胨肉汤(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17. Og,植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. 0g, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水100ml,加热溶解后矫正pH至7. 3±0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅压力15分钟(121°C)灭菌后分装IOmL/瓶备用。3、亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液(SBG):成分酵母浸出物5. 0g，蛋白胨5. 0g, D-甘露醇5. Og,牛磺酸钠I. Og,磺胺抑制剂0. 5g，亚硒酸钠4. 0g, KH2P042. 65g，K2HPO4L 02g,磺绿
5.Omg，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7. 2±0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。煮沸3次后分装9mL/无菌试管备用。其外观为淡绿色透明液体，适用于伤寒、副伤寒和非伤寒、副伤寒沙门菌的增殖培养。4、改良罗伯特增菌液(RVS):成分氯化镁13. 58g，氯化钠7. 2g，5. 0g，木瓜酶消化大豆胨4. 5g, KH2PO4L 26g, K2HPO4O. 18g，孔雀绿36mg，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至 5.2±0.2(按冷却至251后测量值为标准)。煮沸3次后分装9mL/无菌试管备用。其外观为蓝绿色透明液体，适用于非伤寒、副伤寒沙门菌的复苏和增殖培养。5、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板(XLD):成分琼脂13. 5g，乳糖7. 5g，蔗糖7. 5g,硫代硫酸钠6. 8g, L-赖氨酸5. Og,氯化钠5. Og,木糖3. 5g,酵母浸出物3. Og,脱氧胆酸钠2. 5g，枸橼酸铁铵0. 8g，酚红0. 08g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7. 5±0. 2(按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅压力15分钟(121°C)灭菌后倾注无菌平皿置冰箱中，备用。6、沙门菌酶显色琼脂平板(CAS):成分琼脂17. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨10. Og,酵母浸出物3. Og,氯化钠5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-3 -D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg,磺胺抑制剂0. 5g,蒸懼水1000ml。酶显色琼脂平板配方的配制取琼脂粉5g、胰蛋白胨10g、蛋白胨10g、酵母粉3g、氯化钠5g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于5mlTri. HCl (pH8. 0)，称取辛酸盐250mg溶解于5ml蒸馏水中，待加热培养基冷却至50°C—并加入酶底物溶液后混匀，调整pH至7.2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。倾注无菌平板置冰箱中，备用。7、沙门菌生化鉴定管配方
第一管成分琼脂14. Og,牛肉膏2. Og,酵母浸出物2. Og,葡萄糖I. Og,蛋白胨15. Og,甘露醇10. 0g，尿素10. 0g，重量百分浓度为0. 2%的麝香草酚蓝溶液10ml，重量百分浓度为0. 2%的溴麝香草酚蓝溶液12. 5ml,重量百分浓度为0. 2%的甲酚红溶液4ml，蒸馏水IOOOrnl ；
第一管配制
I)、取琼脂14. 0g、牛肉膏2. Og及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤。2)、再取酵母浸出粉2. 0g、葡萄糖I. 0g、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素10. 0g，混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使全部溶解。再加入重量百分浓度为15%的氢氧化钠约I. 5ml，矫正pH至7. I (按冷却至25°C后测量值为标准)。3)、然后加入指示剂重量百分浓度为0. 2%的溴麝香草酚蓝溶液12. 5ml、重量百分浓度为0. 2%的甲酚红溶液4ml、重量百分浓度为0. 2%的麝香草酚蓝溶液10ml。4)、混合后,充分摇勻。分装于13X IOOmm的试管内，每管约3ml。5)、置高压灭菌器内，经10磅压力10分钟的灭菌。6)、灭囷后,制成斜面,底部宜厚。待凝固后，直于冰箱中，备用。
表I指示剂所需量及其配制
权利要求
1.沙门菌分离、鉴定的试剂盒，包括通用型非选择性增菌液、10倍浓缩通用型非选择性增菌液、亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、沙门菌酶显色琼脂平板、沙门菌生化鉴定管、硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条，其特征是还包括改良罗伯特增菌液，组成成分氯化镁13. 58g，氯化钠7. 2g，5. 0g，木瓜酶消化大豆胨4. 5g，KH2PO4L 26g，K2HPO4O. 18g，孔雀绿 36mg，蒸馏水 1000ml。
2.权利要求I所述沙门菌分离、鉴定的试剂盒的制备方法，包括通用型非选择性增菌液、10倍浓缩通用型非选择性增菌液、亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、沙门菌酶显色琼脂平板、沙门菌生化鉴定管、硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条的制备，其特征是还包括改良罗伯特增菌液制备 改良罗伯特增菌液成分氯化镁13. 58g，氯化钠7. 2g，5. 0g，木瓜酶消化大豆胨4. 5g，KH2PO4L 26g, K2HPO4O. 18g，孔雀绿36mg，蒸馏水1000ml，加热溶解后按冷却至25°C后测量值为标准，矫正PH至5. 2±0. 2，煮沸3次后分装9mL/无菌试管备用。
3.权利要求I所述试剂盒在水中沙门菌分离、鉴定中的应用。
4.权利要求I所述试剂盒在食品中沙门菌分离、鉴定中的应用。
全文摘要
本发明涉及沙门菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用，主要解决现有沙门菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明试剂盒，包括通用型非选择性增菌液、10倍浓缩通用型非选择性增菌液、亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、沙门菌酶显色琼脂平板、沙门菌生化鉴定管、硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条，其特征是还包括改良罗伯特增菌液，组成成分氯化镁13.58g，氯化钠7.2g，5.0g，木瓜酶消化大豆胨4.5g，KH2PO41.26g，K2HPO40.18g，孔雀绿36mg，蒸馏水1000ml。本发明主要针对肠道病原菌中沙门菌属(包括伤寒、副伤寒和非伤寒、副伤寒沙门菌)的同步分离和鉴定。
文档编号C12Q1/04GK102796801SQ201210268520
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者许学斌, 袁政安, 金汇明 申请人:上海市疾病预防控制中心