专利名称：志贺菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明是针对肠道病原菌中志贺菌属的试剂盒和使用方法，特别涉及志贺菌属(包括A群痢疾志贺、B群福氏志贺、C群鲍氏志贺、D群宋内志贺)的同步分离和鉴定试剂盒、制备和应用，利用选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定所有志贺菌。
背景技术：
志贺菌属目前分4个群，常见的为福氏志贺菌和宋内志贺菌，由于其在遗传学、生物学特征上和诸多肠杆菌科内的多数非病原菌或 条件病原菌存在生物学和遗传学相似性导致许多实验室在实际工作中无法通过简单的微生物常规分离方法达到分离到所有志贺菌的预期效果；其次，从不同技术属性和分工的实验室能力要求角度考量，存在对志贺菌属(包括A群痢疾志贺、B群福氏志贺、C群鲍氏志贺、D群宋内志贺)在不同检材中分离的技术要求和方法的敏感性要求。中国专利申请201010550372. 3公开了“沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用”，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行分离、检测和鉴定的程序，可应用于食品和其它粪便类样品中沙门菌和志贺菌的同步检测。但是该方法筛选病原菌的检测流程还存在一定局限性，无法满足不同类型实验室的专业实验室的特殊的技术要求；在处理不同类型的标本上没有使实验室的材料与方法的绩效比达到预期效果。
发明内容
本发明目的是提供一种一次可同步分离A-D群志贺菌并利用生化和酶反应试验鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决现有志贺菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明适用不同类型实验室(临床实验室和公共卫生实验室)对不同类型标本选择不同的检测流程，通过对标本有效增菌的预处理或直接专一性分离平板配合简单的糖生化发酵反应模式和细菌特异性酶-底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对A-D群志贺菌同步筛选分离和简易鉴定的效果。本发明的技术方案为志贺菌分离、鉴定的试剂盒试剂盒，包括
I、通用型非选择性增菌液胰酪胨大豆胨肉汤(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. Og, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水1000ml,加热溶解后矫正pH至7·3±0·2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅压力15分钟(121°C )灭菌后分装225mL/瓶备用。2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液胰酪胨大豆胨肉汤(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17. Og,植物蛋白胨3. Og,氯化钠5. Og, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水100ml,加热溶解后矫正pH至7. 3±0. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅压力15分钟(121°C)灭菌后分装IOmL/瓶备用。3、志贺菌增菌液胰化酪蛋白胨20. 0g，氯化钠5. Og, K2HPO4 2. Og, KH2PO4 2. Og,葡萄糖l.Og，吐温-80 I. 5ml，蒸馏水1000ml，15磅压力15分钟，121 °C灭菌，新生霉素50mg (分装前加入)，ρΗ7. 0±0· 2,分装9mL/无菌试管备用。4、液体石蜡油商品化化学纯矿物油或液体石蜡油分装12ml/管，置65°C烘烤灭菌2h备用，用以营造相对厌氧的环境有利志贺菌的增殖。5、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板(XLD):成分琼脂13. 5g，乳糖7. 5g，蔗糖
7.5g,硫代硫酸钠6. 8g, L-赖氨酸5. Og,氯化钠5. Og,木糖3. 5g,酵母浸出物3. Og,脱氧胆酸钠2. 5g，枸橼酸铁铵O. 8g，酚红O. 08g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7. 5±0· 2(按冷却至25°C后测量值为标准)。经15磅压力15分钟(121°C)灭菌后倾注无菌平皿置冰箱中，备用。
6、酶显色琼脂平板成分琼脂17. 0g，胰化酪蛋白胨lO.Og，蛋白胨10. 0g，酵母浸出物3. Og,氯化钠5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg,辛酸盐250mg,磺胺抑制剂0. 5g,蒸懼水1000ml。酶显色琼脂平板配方的配制取琼脂粉5g、胰蛋白胨10g、蛋白胨10g、酵母粉3g、氯化钠5g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于5mlTri. HCl (ρΗ8· 0)，称取辛酸盐250mg溶解于5ml蒸馏水中，待加热培养基冷却至50°C—并加入酶底物溶液后混匀，调整pH至7.2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。倾注无菌平板置冰箱中，备用。7、志贺菌生化鉴定管配方
第一管成分琼脂14. Og,牛肉膏2. Og,酵母浸出物2. Og,葡萄糖I. Og,蛋白胨15. Og,甘露醇10. Og,尿素10. Og,重量百分浓度为0. 2%麝香草酚蓝溶液10ml，重量百分浓度为
0.2%溴麝香草酚蓝溶液12. 5ml，重量百分浓度为0. 2%甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml ； 第一管配制
I)、取琼脂14. 0g、牛肉膏2. Og及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤。2)、再取酵母浸出粉2. 0g、葡萄糖I. 0g、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素
10.0g，混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使全部溶解。再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠约I. 5ml，矫正pH至7. I (按冷却至25°C后测量值为标准)。3)、然后加入指示剂重量百分浓度为0. 2%溴麝香草酚蓝溶液12. 5ml、重量百分浓度为0. 2%甲酚红溶液4ml、重量百分浓度为0. 2%麝香草酚蓝溶液10ml。4)、混合后,充分摇勻。分装于13X IOOmm的试管内，每管约3ml。5)、置高压灭菌器内，经10磅压力10分钟的灭菌。6)、灭囷后,制成斜面,底部宜厚。待凝固后，直于冰箱中，备用。表I指示剂所需量及其配制
指示剂名称 I所需重量I加N/20氢氧化钠溶液I蒸馏水量I敏感范围(pH) I色泽改变(酸一碱)
溴麝香草酉分蓝 O- 2g 6. 4ml_93. 6ml 6. Q-7. 6_黄一蓝_
甲酚红10.6ml89.4ml~ 7.2-8.8黄一红
麝香草g分蓝 |o.2g |8.6ml|91.4ml |l. 2-2.8I红一黄—
第二管成分琼脂3. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨10. 0g，氯化钠5. 0g，重量百分浓度为10%Na2HP042. 5ml，蔗糖10. 0g，重量百分浓度为1%硫代硫酸钠溶液2. 5ml，重量百分浓度为0. 2%溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml。第二管的配制
I)、取琼脂3. 0g，加入IOOOrnl的蒸馏水中，加热溶解，并用数层纱布过滤。
2)、再取胰化酪蛋白胨lO.Og、蛋白胨lO.Og、氯化钠5. Og、重量百分浓度为10%Na2HP042. 5ml、蔗糖10. Og及硫代硫酸钠溶液2. 5ml，混合后，加入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠溶液约I. 5ml左右，矫正pH至7. 6(按冷却至25°C后测量值为标准)。3)、溴麝香草酚蓝的配制取溴麝香草酚蓝0. 2g、N/10氢氧化钠溶液5ml及蒸馏水95ml,混合后，放在掠色瓶中，备用。4)、加重量百分浓度为0. 2%溴磨香草酹蓝5ml。充分摇勻，分装于13X IOOmm的试管内，每管约3ml。5)、置高压灭菌器内，经10磅压力10分钟的灭菌，取出后，置于冰箱中，备用。8、硫化氢滤纸条硫化氢滤纸条的制备选取细薄的滤纸剪成3X 50mm的长条，浸在饱和的醋酸铅溶液中(重量百分浓度为35%醋酸铅饱和)，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中约3h，烤干备用。如硫化氢阳性，此纸条在试管内悬挂末端显黑色。
9、吲哚滤纸条Π引哚滤纸条的制备滤纸条(同上述大小)浸于对一二甲氨基苯甲醒5. 0g、甲醇50ml、磷酸IOml的混合液中，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中约4h,稍微烤干即取出，保存室温内备用。此纸条经对一二甲氨基苯甲醛染成淡黄色，如靛基质阳性，此纸条在试管内悬挂末端显红色。志贺菌分离、鉴定的试剂盒使用方法
I、标本采集和处理
I)、粪便挑取粪便标本直接接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板，36°c培养18h-24h观察菌落生长结果；若有典型菌落生长者分别挑选2-3个单个菌落同时于接种志贺菌生化鉴定管和酶显色琼脂平板，36°C培养18h-24h观察，判断依据见表2 :
表2简易生化和特异性酶-底物反应试验结果
权利要求
1.志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，包括通用型非选择性增菌液、10倍浓缩通用型非选择性增菌液、志贺菌增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、酶显色琼脂平板、志贺菌生化鉴定管、硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条，其特征是还包括液体石蜡油。
2.权利要求I所述志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒制备方法，首先包括通用型非选择性增菌液、10倍浓缩通用型非选择性增菌液、志贺菌增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、酶显色琼脂平板、志贺菌生化鉴定管、硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条制备，其特征是还包括使用液体石蜡油营造相对厌氧的环境有利志贺菌的增殖步骤液体石蜡油商品化化学纯矿物油或液体石蜡油分装12ml/管，置65°C烘烤灭菌2h备用。
3.权利要求I所述试剂盒在水中志贺菌同步分离、鉴定中的应用。
4.权利要求I所述试剂盒在食品中志贺菌同步分离、鉴定中的应用。
全文摘要
本发明是针对肠道病原菌中志贺菌属的试剂盒和使用方法，主要解决现有志贺菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明试剂盒包括通用型非选择性增菌液、10倍浓缩通用型非选择性增菌液、志贺菌增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板、酶显色琼脂平板、志贺菌生化鉴定管、硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条，其特征是还包括液体石蜡油。利用选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定所有志贺菌。
文档编号C12R1/01GK102816828SQ20121026844
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者许学斌, 袁政安, 金汇明 申请人:上海市疾病预防控制中心