福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增的制作方法
【专利摘要】本发明涉及福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增，所述引物包括序列：SEQ?ID?Nos.2和3、SEQ?ID?Nos.4和5、SEQ?ID?Nos.6和7、SEQ?ID?Nos.8和9、SEQ?ID?Nos.10和11、SEQ?ID?Nos.12和13、SEQ?ID?Nos.14和15、SEQ?ID?Nos.16和17、SEQ?ID?Nos.18和19。所述的引物具有特异性，退火温度一致。本发明还涉及利用所述引物进行多重扩增检测的方法。本发明进一步涉及所述福氏志贺菌血清型检测用引物在制备检测剂中的应用。本发明进一步涉及包含上述引物的福氏志贺菌血清型检测用试剂盒。
【专利说明】福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及福氏志贺菌检测用引物和使用所述引物的多
重扩增。
【背景技术】 [0002]志贺菌(Shigella)是发展中国家细菌性腹泻的主要致病菌。每年全球有164.7百万人感染，导致11万人死亡，大多是5岁以下的儿童(Kotloff，K.L.，J.P.Winickoff, B.1vanoff, J.D.Clemens，D.L Swerdlow, P.J.Sansonetti，G.K.Adak, andΜ.M.Levine.1999.Global burden of Shigella infections !implications for vaccinedevelopment and implementation of control strategies.Bull World Health Organ77:651-66)。在志贺菌的四群中，福氏是影响贫穷人群的主要流行群。
[0003]根据O抗结构的不同，福氏志贺菌分为不同的血清型。目前为止，至少16个血清型已被报道，分别是 la, Ib，Ic，Id，2a，2b，3a，3b，4a，4b，5a，5b，X，Xv，Y 和 6 (Simmons, D.A.，and E.Romanowska.1987.Structure and biology of Shigella flexneri 0 antigens.J Med Microbiol23:289-302 ;Stagg，R.M.，S.S.Tang, N.1.Carlin, K.A.Talukder,P.D.Cam, and N.K.Verma.2009.A novel glucosyItransferase involved in 0—antigenmodification of Shigella flexneri serotypelc.J Bacteriol 191:6612-7 ;Ye，C.，R.Lan, S.Xia，J.Zhang, Q.Sun，S.Zhang, H.Jing，L Wang, Z.Li，Z.Zhou, A.Zhao, Z.Cui，J.Cao, D.Jin, L Huang, Y.Wang, X.Luo, X.Bai，P.Wang, Q.Xu, and J.Xu.2010.Emergence ofa new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of Shigellaflexner1.J Clin Microbiol 48:419-26)。
[0004]鉴定福氏痢疾杆菌及其它群痢疾杆菌的血清型主要采用免疫动物的抗血清与分离菌株进行玻片凝集反应，根据免疫凝集结果进行判定(Edwards, P.R., and W.H.Ewing.1dentification of Enterobacteriaceae.Burgess Publishing Company, Minneapolis,Minn, 126-131 (1972))。目前,福氏痢疾杆菌血清型诊断系统已经建立(Ewing,W.H.Edwardsand Ewing' s identification of Enterobacteriaceae,.Elsevier Science PublishingCo, Inc, New York.4th ed., 135-172 (1986)),多种商业化诊断血清亦广泛应用。不同的血清型具有独特的血清凝集谱(表1)，根据现有的诊断血清，大多数菌株能够归于目前已知的血清型。
[0005]最近，几种新血清型被不断报道。其中某些已经成为优势血清型(Talukder etal.，2003)。2001年，在中国河南省出现一种新的血清型Xv，在随后的几年内(2002-2006)，它取代2a成为河南省优势血清型，分别占分离福氏志贺菌的14 %，35 %，47 %，48 %，和27% (Ye et al.,2010) ? Xv血清型也在山西出现，分别占67% (2006)和33% (2007)。在甘肃、安徽和上海2007年的分离率分别是67%、54%和35% (Ye et al.，2010)。
[0006]血清型Xv能够与单克隆抗体MASFIV-1和群7，8抗血清凝集(Ye et al.，2010)，因此它最初被称为 4c 或 4x(Carlin & Lindberg, 1987 ；Pryamukhina & Khomenko, 1988) ?相对于X血清型，Xv血清型菌株在它的LPS上含有MASF IV-1 (或称为E1037)抗原位点(YeC，Lan RiXia S，Zhang J，Sun Q，et al.(2010)Emergence of a new multidrug-resistantserotype X variant in an epidemic clone of Shigella flexner1.J Clin Microbiol48:419-426)。
[0007]此外，一些非典型血清型不断被分离到，如Yv (也称为4x，Y，或4s，本发明中命名为Yv)(Talukder KAiDutta DK,Safa A，Ansaruzzaman M，Hassan F，et al.(2001)Alteringtrends in the dominance of Shigella flexneri serotypes and emergence ofserologically atypical S.flexneri strains in Dhaka,Bangladesn.J Clin Microbiol39:3757-3759.Qiu S，Wang Z,Chen C，Liu N，Jia L，et al.(2011)Emergence of a novelShigella flexneri serotype 4s strain that evolved from a serotype X variantin China.J Clin Microbiol 49:1148-1150.Carlin NI，Rahman M，Sack DA, Zaman A，Kay B，et al.(1989)Use of monoclonal antibodies to type Shigella flexneri inBangladesh.J Clin Microbiol 27:1163-1166)，它能够特异地与 MASFIV-1 单克隆抗体凝集(表 I) ;4av(也称为 4 或 untypcal 4a，本发明中命名为 4av) (Talukder KA, Dutta DK,Safa A，Ansaruzzaman M，Hassan F，et al.(2001)Altering trends in the dominance ofShigella flexneri serotypes and emergence of serologically atypical S.flexneristrains in Dhaka,Bangladesn.J Clin Microbiol 39:3757-3759.Carlin NI，Rahman M，Sack DA，Zaman A,Kay B，et al.(1989)Use of monoclonal antibodies to type Shigellaflexneri in Bangladesn.J Clin Microbiol 27:1163-1166)，除了能够与血清 4 型特异的MASFIV-2凝集外，还能够与MASFIV-1单克隆抗体凝集(表1)。Foster等人发现了一种非典型血清型(7b)，它能够与MASF IC和6抗血清发生反应(Foster RA, Carlin NI，Majcher M，Tabor H,Ng LK,et al.(2011) Structural elucidation of the 0-antigen ofthe Shigella flexneri provisional serotype 88—893:structural and serologicalsimilarities with S.flexneri provisional serotype Y394 (Ic).Carbohydr Res 346:872-876)(表1)，按照目前的血清型标准，它不能归于目前已知的任何血清型。
`[0008]表1福氏志贺菌已知和非典型血清型凝集谱
[0009]
【权利要求】
1.一套福氏志贺菌血清型检测用引物，其包括以下序列:SEQ ID Nos.2和3、SEQ IDNos.4 和 5、SEQ ID Nos.6 和 7、SEQ ID Nos.8 和 9、SEQ ID Nos.10 和 11、SEQ ID Nos.12和 13、SEQ ID Nos.14 和 15、SEQ ID Nos.16 和 17、SEQ ID Nos.18 和 19。
2.根据权利要求1所述的福氏志贺菌检测用引物，其还包括以下序列:SEQID Nos.29和30。
3.—种多重扩增检测方法，该方法包括利用权利要求1所述的引物进行扩增；优选所述扩增为聚合酶链式反应。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述扩增条件为:95°C预变性15min;94°C变性30s, 50~60°C退火90s，72。。延伸60s，共30个循环；最后72°C延伸IOmin0
5.根据权利要求3或4所述的方法，该方法进一步包括在所述扩增之后进行定性分析；优选所述的定性分析包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。
6.权利要求1或2所述的福氏志贺菌血清型检测用引物在制备检测剂中的应用，所述的检测剂用于检测福氏志贺菌血清型，或者用于检测包含福氏志贺菌的的鉴别诊断用样品O
7.根据权利要求6所述的应用，所述的检测剂用于对排泄物、肠积液、呕吐物、土壤、水样、食品或化妆品进行检测。
8.一种福氏志贺菌检测用试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物。
9.根据权利要求8所述的检测用试剂盒，该试剂盒还包括以下标记或未标记的探针: SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21、SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.24、SEQ IDN0.25、SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.28。
10.权利要求1或2所述的引物、或权利要求3~5任一项所述的方法、或权利要求8或9所述的试剂盒在鉴定福氏志贺菌新的血清型中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103589778SQ201210288889
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月14日 优先权日:2012年8月14日
【发明者】孙强正, 王建平, 徐建国 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所