一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法
【专利摘要】本发明涉及一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需基因的方法，所述方法以BmNPV为材料，通过PCR对其一个复制非必需片段两端的同源序列进行扩增并克隆至载体pUC19中；通过重叠PCR法依次拼接BmNPV的IE1早期启动子、标记基因(EGFP)、终止序列SV40polyA，并克隆至上述载体pUC19获得重组转移载体pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64；将该载体与野生BmNPV的基因组共转染BmN细胞，经同源重组获得带有荧光标记的重组病毒RBmNPV-EGFP；将其基因组DNA与不带有标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64共转染BmN细胞，通过同源重组获得不带有荧光标记基因的重组病毒RBmNPV。本发明解决了重组病毒基因组中带有标记基因的问题，提高了阳性重组病毒的筛选效率，且此标记基因可以被反复利用。
【专利说明】—种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA重组技术和基因打靶【技术领域】，特别涉及一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法。【背景技术】
[0002]基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。也是研究基因功能的重要手段。现在基因敲除技术被广泛的应用于病毒基因组功能的研究中。所以一般设计一种替换型载体与病毒基因组共转染细胞来缺失基因。但是病毒基因组上留有标记基因的问题，还未进行全面的改善，这给病毒本身的功能带来了巨大的影响以及后续的病毒筛选也带来了很大的麻烦，因此我们采用两次同源重组的方法既缺失了靶基因又解决了病毒基因组上带有标记基因的难题，这为以后的科学实验有着重要的意义。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可敲除家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需基因的带有标记基因的转移载体pUC19-1El-EGFP-SV40polyA及其制备方法。
[0004]为达到上述目的，本发明提供一种带有标记基因的转移载体的制备方法，所述方法包括以下步骤:
1)用PCR的方法依次获得基因:IE、EGFP、SV40polyA；
2)采用重叠PCR方法依次拼接IE1、EGFP，以IEl-EGFP的连接产物作为亚基因与基因SV40polyA进行拼接，获得三联体基因IEl-EGFP_SV40polyA ；
3)将步骤2)所得的三联体基因IEl-EGFP-SV40polyA克隆至载体pUC19中，获得转移载体 pUC19-1El-EGFP-SV40polyA ；
4)转移载体pUC19-1El-EGFP-SV40polyA转化DH5a大肠杆菌感受态细胞；
5)蓝白斑筛选(含氨节青霉素Ampicillin的固体培养基)，挑取含有转移载体pUC19-1E1-EGFP-SV40poIyA 的白色菌落。
[0005]6)转移载体pUC19-1El-EGFP-SV40polyA进行PCR和双酶切鉴定并送华大基因测序。
[0006]本发明进一步提供一种带有标记基因的转移载体，通过上述的方法制得。
[0007]本发明目的之二在于提供一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，以解决重组病毒基因组上含有标记基因的难题，且此标记基因可被重复利用。
[0008]为达到上述目的，本发明还提供一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，所述方法包括以下步骤:1)抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组；
2)PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64；
3)将步骤2)所得的同源序列lef7、gp64克隆至上述的转移载体pUC 19-1E1-EGFP-SV40po I yA 中，获得重组转移载体 pUC19-lef7-1El-EGFP_SV40polyA-gp64，并与家蚕核型多角体病毒基因组共转染BmN细胞，经同源重组获得带有EGFP标记(荧光蛋白标记基因)的重组病毒RBmNPV-EGFP，对该重组病毒RBmNPV-EGFP进行鉴定并扩大培养;
4)提取重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64 (通过脂质体介导转染法)共转染BmN细胞；
5)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV，扩大培养用于后续实验。
[0009]本发明的有益效果:一是利用本发明构建的转移载体可以连续敲除BmNPV基因组中不同转录时相的复制非必需基因，无需构建太多的载体；二是选用绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因，可以快速、直观地获得重组病毒；三是经两次同源重组解决了重组病毒基因组中含有标记基因的问题，且此标记基因可以重复使用，无需更换标记基因。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1 为 IEl , EGFP, SV40polyA 三个基因的电泳图；M:10kb DNA 标记；1:1E1 的PCR 产物；2 =EGFP 的 PCR 产物；3:SV40polyA 的 PCR 产物；
图2为IEl与EGFP的重叠PCR的电泳图；M:1Okb DNA标记；1:1El-EGFP的PCR产
物；
图3 为三联体基因IEl-EGFP-SV40polyA的电泳图；M:10kb DNA标记；1:1El-EGFP-SV40polyA 的 PCR 产物；
图4为转移载体pUC19-1El-EGFP-SV40polyA的PCR及双酶切鉴定图；M:10kb DNA标记；1: pUC19-1El-EGFP-SV40polyA 的 PCR 产物;2: pUC19-1El-EGFP_SV40polyA 的双酶切产物；
图5为转移载体pUC19-1El-EGFP-SV40polyA-gp64的PCR及双酶切鉴定图；M:10kb DNA 标记；I:pUC19-1El-EGFP-SV40polyA-gp64 的 PCR 产物；2:pUC19-1El-EGFP-SV40polyA-gp64 的双酶切产物；
图 6 为重组转移载体 pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40polyA-gp64 的 PCR 及双酶切鉴定图；M:10kb DNA 标记；I:pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40-gp64 的 PCR 产物；2:pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40-gp64 的双酶切产物；
图7为家蚕正常细胞的显微图；
图8为只转染了重组转移载体pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40polyA-gp64的家蚕细胞的显微荧光图；
图9为重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与重组转移载体pUC19-lef7-1El-EGFP_SV40polyA-gp64共转染的显微突光图；
图10为重组质粒pUC19-LEF7的PCR及双酶切鉴定图；M:10kb DNA标记；1:PUC19-LEF7的PCR产物；2:pUC19_LEF7的双酶切产物；
图11为无标记基因的转移载体PUC19-LEF7-GP64的PCR及双酶切鉴定图；M:10kb DNA标记；1:pUC19-LEF7-GP64 的 PCR 产物；2:pUC19-LEF7_GP64 的双酶切产物。
【具体实施方式】
[0011]应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。
[0012]在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂和培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。
[0013]通过对BmNPV基因组的分析与研究，推测BmNPV的50%左右的基因对于病毒在培养细胞中的增殖是非必需的。杆状病毒基因组可以较大区域的缺失，从而增加了外源基因表达的有效途径。此外，通过去除某些基因，如半胱氨酸蛋白酶(cysteine)、组织蛋白酶(cathepsin)、几丁质酶(chitinase)基因能增进重组蛋白的稳定性。本发明就以同时敲除组织蛋白酶(cathepsin)和几丁质酶(chitinase)为例来阐述`
【发明内容】
。
[0014]组织蛋白酶(cathepsin)和几丁质酶(chitinase)是BmNPV的晚期表达基因，在基因组中处于相邻的位置，且转录方向相反，是家蚕核型多角体杆状病毒复制的非必需基因，据相关文献报道敲除之后对病毒基因的复制没有影响。
[0015]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
[0016]实施例1:转移载体 pUC19-1El-EGFP_SV40polyA 的构建:
1、以高珍等构建的重组质粒PSK-1E1-EGFP(高珍，洪叶挺，周芳等.家蚕BmAGOl基因的克隆、表达分析及其结合RNA的分离与鉴定[0L].[2012-01-09],中国科技论文在线，http://www.paper, edu.cn/index, php/default/releasepaper/content/201201-252)为模板分别设计:
(IE-1)F: 5- TTIY?7TG^AGTCGTTTGGTTGTTCACGATCG-3 (加粗倾斜部分为 fe7I 的酶切位点)
(IE-1)R: 5-CTCGCCCTTGCTCACCATGATTTGCAGTTCGGGACATAAAT-3
(EGFP)F: 5-TTATGTCCCGAACTGCAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3
(EGFP)R: 5-AATGTGGTATGGCTGATTATGATCTTACTTGTACAGCTCGTC-3
(SV40polyA) F: 5- CATGGACGAGCTGTACAAGTAAGATCATAATCAGCCATACC-3
(SV40po I yA) R: 5_CGG^7^CrATCCAGACATGATAAGATACATTG-3 (加粗倾斜部分为 KpnI
的酶切位点)(三个基因的PCR结果见图1)，与预期的大小一致。
2、通过重叠PCR的方法拼接三联体基因:IE1-EGFP-SV40(如图2、图3所示)，其中IEl的碱基序列如SEQ ID NO:1所示，EGFP的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，SV40polyA的喊基序列如SEQ ID NO:3所不:
(I)IEl与EGFP连接的PCR反应体系如下:
【权利要求】
1.一种带有标记基因的转移载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (a)用重叠PCR的方法制备三联体基因:IEl-EGFP-SV40polyA； (b)将步骤(a)所得的IEl-EGFP-SV40polyA克隆至载体pUC19中，获得所述转移载体pUCI9-1E1-EGFP-SV40poIyA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括: (c)转移载体pUC19-1El-EGFP-SV40polyA转化DH5a大肠杆菌感受态细胞； (d)在含氨苄青霉素的固体培养基上进行蓝白斑筛选，挑取含有转移载体pUC 19-1E1-EGFP-SV40po I yA 的白色菌落； (e)转移载体pUC19-1El-EGFP-SV40polyA进行PCR和双酶切鉴定，并测序。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)具体包括: 1)用PCR的方法依次获得基因:IE、EGFP、SV40polyA； 2)采用重叠PCR方法依次拼接IE1、EGFP，以IEl-EGFP的连接产物作为亚基因与基因SV40polyA进行拼接，获得三联体基因IEl-EGFP_SV40polyA。
4.一种带有标记基因的转移载体，其特征在于，所述转移载体通过权利要求1-3任一所述的方法制得。
5.一种靶向敲除家蚕核型多角体病毒复制非必需基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)制备家蚕核型多角体病毒BmNPV复制非必需片段两端的同源序列:lef7、gp64； (2)将步骤(1)所得的同源序列lef7、gp64依次克隆至权利要求2所述的转移载体pUC 19-1E1-EGFP-SV40po I yA 中，获得重组转移载体 pUC19-lef7-1El-EGFP_SV40polyA-gp64，并与家蚕核型多角体病毒基因组共转染BmN细胞，经同源重组获得带有EGFP标记的重组病毒 RBmNPV-EGFP ； (3)提取重组病毒RBmNPV-EGFP的基因组与无标记基因的转移载体pUC19-lef7-gp64共转染BmN细胞； (4)筛选无标记基因的重组病毒RBmNPV。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括: 1)抽提家蚕核型多角体病毒BmNPV基因组； 2)PCR方法获得复制非必需片段两端的同源序列LEF7、gp64。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中重组转移载体pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40polyA-gp64与家蚕核型多角体病毒基因组通过脂质体介导转染法共转染BmN细胞。
【文档编号】C12N15/66GK103589745SQ201210288003
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月14日 优先权日:2012年8月14日
【发明者】田凤鸣, 陈剑清, 舒特俊, 张耀洲 申请人:天津耀宇生物技术有限公司