一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法

一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，尤其涉及一 种细胞冻存复苏后高效扩增的方法，该方法可以进行成人免疫细胞的储存及后期复苏培养 应用临床治疗项目。
【背景技术】
[0002] 免疫细胞（immune cell)是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特 指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体 内分布很广泛，主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化（activation)，分裂增 殖、发生特异性免疫应答。T淋巴细胞是一个多功能的细胞群。除T淋巴细胞和B淋巴细 胞外，还有一种淋巴细胞为自然杀伤细胞（natural killer cells，NK)。除淋巴细胞外，参 与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细 胞。
[0003] 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，即外周血中具 有单个核的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。PBMC是将 白细胞进一步提取的、具有分化为更强大效应细胞的一部分。通过特定因子的诱导，PBMC 在体外可以分化为多种免疫细胞，如现在广泛应用于生物治疗的细胞因子诱导的杀伤细胞 (cytokine induced killer，CIK)，树突状细胞（dendritic cells，DCs)和自然杀伤细胞 (NK)等细胞。
[0004] 最新版的《世界癌症报告》由世卫组织下属的官方癌症机构国际癌症研究中心 (IARC)负责，来自40多个国家的250多位科学家参与编撰，对全球180多个国家的28种癌 症的总体情况和流行趋势进行了全面的描述和分析，这也是6年来首篇概述全球癌症情况 的报告。
[0005] 报告预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至 2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。
[0006] 报告还显示，非洲、亚洲和中南美洲的发展中国家癌症发病形势最为严峻。2012年 全世界共新增1400万癌症病例并有820万人死亡。其中，中国新增307万癌症患者并造成 约220万人死亡，分别占全球总量的21. 9%和26. 8%。世卫的数据略低于中国自己的统计。 全国肿瘤登记中心发布的2012年数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万 人因此死亡。
[0007] 细胞免疫治疗有可能成为癌症治疗的主要手段。目前临床试验效果显示，细胞免 疫治疗在一些较难治疗的癌症病例中，取得较为突出的临床效果和生存数据，是继手术 和放疗、化疗后的一项突出有效的治疗方式。目前该治疗方式在国际上取得极大关注，如 2011年《Nature》杂志发表文章认为"癌症细胞免疫治疗即将迎来新一轮的研究高潮，未 来有可能在癌症治疗中占据相当重要的地位"；2012年底，《Science》杂志将癌症免疫治 疗列为2013年最值得关注的六大科学领域之一。科学界的关注，表明该治疗方式的巨大 潜力，但也说明该方法目前还处于比较早期，在临床试验中研究较多，产业化需要逐步推 进。
[0008] 据了解，人的免疫力在20岁的时候达到巅峰，40岁时免疫力只有巅峰时的1/2,到 了 70岁更是只剩下巅峰时期的1/10,免疫力下降意味着免疫细胞对抗病毒、细菌以及癌变 的能力逐年降低，患病风险也相对提高。而在年轻、健康的情况下储存优质免疫细胞，则是 给人体生命的一份保障，也是为人体健康储存了一份希望。

【发明内容】

[0009] 本发明为了解决现有PBMC提取率较低、细胞冻存液含有动物血清、冻存细胞活率 低下及复苏后细胞扩增能力不足等技术中存在的问题而提出的。
[0010] 本发明的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞的方法，它是按照以下 步骤进彳丁的：
[0011] 一、对采集到的成人外周静脉血进行分离纯化，获得外周血单个核细胞；
[0012] 二、对得到的外周血单个核细胞进行清洗，纯化；
[0013] 三、用冻存液重悬外周血单个核细胞进行稀释，使细胞悬液密度达到1~10X 107个/mL ;
[0014] 四、将稀释后的细胞悬液分装至1. 8mL冻存管中，每管添加 lmL，并留样待检，将细 胞冻存管放入4°C预温的程序降温盒中，转移到-80°C冰箱暂时储存；
[0015] 五、预留的冻存细胞悬液进行细菌、真菌、内毒素和支原体等指标的检测，指标检 测合格后，冻存入库做长期保存；
[0016] 六、复苏时，将从冻存入库中取出的细胞转入预温至-80°C的冻存盒内后，平衡 5min转入37°C水浴融化；
[0017] 七、将融化后的细胞转移至含质量百分含量为10%人血白蛋白的生理盐水混合液 中洗涤，检测细胞活率，之后将细胞重悬于含有质量百分含量为10 %人血白蛋白的无血清 培养体系中接种培养，即完成所述的长期储存成人外周血单个核细胞。
[0018] 本发明包含以下有益效果：
[0019] 本发明有别于其他储存免疫细胞方式，是以细胞纯化及浓缩为手段，可将抽取的 血液中免疫细胞保留比例提高至传统方法的2到3倍，细胞复苏存活率高达95%以上，同 时冻存细胞收率在95%以上（冻存后与冻存前细胞计数比值），本发明的方法一次可冻存 超过15亿个种类完整的免疫细胞，包含树突状细胞、自然杀伤（NK)细胞及T细胞等，可有 效应用于多种免疫细胞疗法并可供多次治疗使用。正常情况下，免疫细胞保存期为20年左 右。目前国际上通用的免疫细胞保存技术是将获得的免疫细胞储存在_196°C深低温状态， 医学研究与临床实践证明保存一百年以上的细胞仍然具有其生物活性。在免疫细胞保存期 间，可根据客户要求进行定期复苏、扩增，满足客户长期存储的需求的同时还可以用于客户 指定的免疫细胞治疗等服务。同时，由于储存及后期复苏培养过程中没有任何动物源血清 或蛋白的添加，保障了临床应用的安全性及稳定性，大大降低应用后的副反应发生情况。
【附图说明】
[0020] 图1为成人PBMC提取效率图；
[0021 ] 图2为成人PBMC复苏活率图；
[0022] 图3为CIK诱导培养扩增倍数图；
[0023] 图4为成人PBMC冻存后复苏回收率图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0024] 一：本实施方式的一种长期储存及复苏培养成人外周血单个核细胞 的方法，它是按照以下步骤进行的：
[0025] -、对采集到的成人外周静脉血进行分离纯化，获得外周血单个核细胞；
[0026] 二、对得到的外周血单个核细胞进行清洗，纯化；
[0027] 三、用冻存液重悬外周血单个核细胞进行稀释，使细胞悬液密度达到1~10X 107个/mL ;
[0028] 四、将稀释后的细胞悬液分装至1. 8mL冻存管中，每管添加 lmL，并留样待检，将细 胞冻存管放入4°C预温的程序降温盒中，转移到_80°C冰箱暂时储存；
[0029] 五、预留的冻存细胞悬液进行细菌、真菌、内毒素和支原体等指标的检测，指标检 测合格后，冻存入库做长期保存；
[0030] 六、复苏时，将从冻存入库中取出的细胞转入预温至-80°C的冻存盒内后，平衡 5min转入37°C水浴融化；
[0031] 七、将融化后的细胞转移至含质量百分含量为10%人血白蛋白的生理盐水混合液 中洗涤，检测细胞活率，之后将细胞重悬于含有质量百分含量为10 %人血白蛋白的无血清 培养体系中接种培养，即完成所述的长期储存成人外周血单个核细胞。
[0032] 本实施方式有别于其他储存免疫细胞方式，是以细胞纯化及浓缩为手段，可将抽 取的血液中免疫细胞保留比例提高至传统方法的2到3倍，细胞复苏存活率高达95%以上， 同时冻存细胞收率在95%以上（冻存后与冻存前细胞计数比值），本实施方式的方法一次 可冻存超过15亿个种类完整的免疫细胞，包含树突状细胞、自然杀伤（NK)细胞及T细胞 等，可有效应用于多种免疫细胞疗法并可供多次治疗使用，是业界储存免疫细胞种类最多、 数量最完整的细胞储存技术。正常情况下，免疫细胞保存期为20年左右。目前国际上通用 的免疫细胞保存技术是将获得的免疫细胞储存在_196°C深低温状态，医学研究与临床实践 证明保存一百年以上的细胞仍然具有其生物活性。在免疫细胞保存期间，可根据客户要求 进行定期复苏、扩增，满足客户长期存储的需求的同时还可以用于客户指定的免疫细胞治 疗等服务。
【具体实施方式】 [0033] 二：本实施方式与一不同的是：步骤一中获得外周 血单个核细胞的方法为：离心收集成人外周静脉血，并水浴灭活，离心收集血浆上清液，每 10mL分装一支，-80°C保存，备用；采用淋巴细胞分离液分离血细胞中的单个核细胞，并收 集单个核细胞。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0034] 三：本实施方式与一不同的是：步骤二中对得到的外 周血单个核细胞进行清洗，纯化的具体操作如下：用复方电解质溶液洗涤单个核细胞两次， 收集最后一次洗涤的上清液，并进行细菌、真菌、支原体和内毒素检测，检测合格后，离心收 集的细胞待用。其它与一相同。
[0035]
【具体实施方式】四：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：步骤三中的冻存液配 制如下：按细胞无血清培养基、人血白蛋白和DMSO的体积比为4:5:1的比例混合而成。其 它与【具体实施方式】一相同。
【具体实施方式】 [0036] 五：本实施方式与一不同的是：冻存液中的人血白蛋 白的质量分数至少为10%。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0037] 六：本实施方式与一不同的是：步骤五中指标检测合 格是指：细菌、真菌、支原体检测皆为阴性，内毒素含量不高于0. 25EU/mL。其它与具体实施 方式一相同。
【具体实施方式】 [0038] 七：本实施方式与一不同的是：该方法所用试剂为药 用或GMP级别。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0039] 八：本实施方式与一不同的是：步骤七中无血清培 养体系中含有单克隆抗体和细胞因子；其中，单克隆抗体的在无血清培养体系中的浓度为 500ng/mL。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0040] 九：本实施方式与一不同的是：细胞因子为浓度20~ 100ng/ml GM-CSF、0. 5 ~4ng/ml IL-1α、1〇〇〇 ~4000IU/ml IL-2、5 ~30ng/ml IL-4、 0.25 ~2ng/ml IL-7、0.2 ~2ng/ml IL-12、0.25 ~2ng/ml I