一种外周血中抗ny-eso-1自身抗体的检测方法

一种外周血中抗ny-eso-1自身抗体的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种外周血中抗NY?ESO?1自身抗体的检测方法，所述方法以NY?ESO?1重组蛋白为抗原制备抗NY?ESO?1抗体，将抗NY?ESO?1抗体与胶乳微球偶联制备抗体偶联物，然后将NY?ESO?1重组蛋白混合液a与外周血待测样品混合反应5?10min，最后再加入抗体偶联物，检测546nm处吸光值，根据标准曲线获得样品中抗NY?ESO?1自身抗体浓度；本发明还提供一种外周血中抗NY?ESO?1自身抗体的化学发光检测方法。本发明所述外周血中抗NY?ESO?1自身抗体的检测方法可在生化分析仪和化学发光免疫分析仪等大型自动化仪器上进行大样本自动化检测，灵敏度1?10ng/mL。
【专利说明】
一种外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法 (一)
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法。 (二)
【背景技术】
[0002] NY-ES0-1是癌-睾丸抗原（cancer-testis antigen，CTA)家族中的重要成员，在肿 瘤抗原中具有较强免疫原性，在多种肿瘤中广泛表达，而在正常组织中几乎不表达。NY-ES0-1抗原最初从食管癌组织中筛选得到的（Chen YT，et al.Cancer J.2000,6 Suppl3: S208-217.)。此后，发现NY-ES0-1在神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌等多种肿 瘤组织中均表达较高，在结直肠癌、肝癌、尿路上皮癌、多发性骨髓瘤、肺癌中也有一定程度 表达（Rodolfo M，et al.Cancer Research.2003,63:6948-6955;Jungbluth AA，et al. International J Cancer.2001,94:252-256；Barrow C,et al. Clinical Cancer Research.2006,12:764-771；Odunsi K,et al.Cancer Research.2003,63:6076-6083； Nakamura S,et al.J Gastroenterology and Hepatology·2006,21:1281-1285·)〇NY-ES0-1基因家族包括NY-ES0-ULAGE-1和ES03三个成员，不同于NY-ES0-1和LAGE-1特异性表 达于肿瘤组织，ES03广泛表达于人体各种正常组织，不具肿瘤限制性。NY-ES0-1基因mRNA编 码区长度543bp，编码蛋白质相对分子量约18kD，由180个氨基酸组成，其N端有富含甘氨酸， C端存在疏水性氨基酸序列，有潜在跨膜区域。NY-ES0-1有20多个CD4+或CD8+T细胞识别表 位，并在多种肿瘤内可检测到自发性免疫反应（Chen JL，et al.International J Cancer. 2015，136:E590-601.)。已发现第 155-163位氨基酸（QLSLLMWIT)、第 157-165位氨基 酸(SLLMWITQC)和第157-167位氨基酸（SLLMWITQCFL)3个抗原肽可诱导NY-ES0-1阳性肿瘤 患者产生CTL反应，可应用于肿瘤免疫治疗（Karbach J，et al.International J Cancer · 2007，121:2042-2048 ·) JY-ESO-l作为免疫原性较强的CTA，可活化CD4+和CD8+T淋 巴细胞，诱导机体产生针对肿瘤的细胞和体液免疫应答。NY-ES0-1肽链中T淋巴细胞识别表 位主要以HLA-A2和HLA-DR限制性抗原肽为主。由于生殖细胞不表达HLA分子和血睾屏障存 在，针对CTA的肿瘤免疫治疗一般对正常组织细胞不产生免疫毒性，目前NY-ES0-1被认为是 肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。
[0003] NY-ES0-1作为一种重要的肿瘤相关抗原，在肿瘤早期诊断，发生发展，治疗效果评 价等方面也具有重要价值。由于NY-ES0-1在多种肿瘤组织中表达，而几乎不在正常组织中 表达，其在肿瘤诊断中具有较高特异性，而且NY-ES0-1在肿瘤预后判断也有重要意义，研究 发现肿瘤细胞表达NY-ES0-1提示预后较差（Ohue Y，et al.0ncoimmunology.2014,3: e970032.)。在乳腺髓样癌患者中，雌激素受体阴性者肿瘤组织NY-ES0-1阳性率高于雌激素 受体阳性者，NY-ES0-1阳性患者生存期低于NY-ES0-1阴性患者(Ademuyiwa F0，et al.PloS one. 2012，7: e38783.)。也有研究对头颈部鳞癌患者进行多因素分析后认为NY-ES0-1是其 不良预后的独立指标（Laban S，et al· International J Cancer.2014,135:1142-1152·)。 CTA参与初期阶段胚胎发育和干细胞自我更新，其在肿瘤组织中表达局限于具有干细胞特 性的细胞，CT基因表达细胞可能是异常肿瘤干细胞克隆增殖的结果。表达CTA的肿瘤细胞失 去了分化能力，并且可能参与肿瘤复发和转移(Colombo M,et al.International Reviews Immunology.2015,34:188-199.)。肿瘤干细胞中CT基因表达已应用于肿瘤复发和转移的治 疗。有研究从神经胶质瘤细胞系和组织中分离出肿瘤干细胞，相较于分化细胞，肿瘤干细胞 中NY-ES0-1表达显著升高。此外，NY-ES0-1也是非小细胞肺癌预后标志之一（John T，et al.PloS one.2013,8:e67876·)。
[0004] 由于NY-ES0-1是一个隐蔽抗原，同时又能有效诱导机体的细胞和体液免疫应答， 表达NY-ES0-1的肿瘤细胞由于坏死或分泌方式释放表达的NY-ES0-1抗原入血，刺激机体免 疫细胞产生针对NY-ES0-1的自身循环抗体，因此，通过检测外周血中特异性的NY-ES0-1自 身循环抗体可作为一个肿瘤标志物，用于肿瘤筛查、辅助诊断和预后判断，判断肿瘤细胞表 达NY-ES0-1抗原状况，也可用于监测和评价肿瘤患者细胞对免疫治疗的反应性。 (三)
【发明内容】

[0005] 本发明目的是提供一种人血清等体液中抗NY-ES0-1自身抗体的测定方法，即用于 外周血(包括血清、血浆和全血)等体液中抗NY-ES0-1自身抗体(包括I gG、I gA和I gM抗体）的 检测。本发明为肿瘤高危人群诊断提供一种新的肿瘤标志物，也为NY-ES0-1阳性肿瘤的精 准治疗和/或CAR-T、TCR-T等个性化免疫治疗疗效判断提供依据。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法，所述方法为：以NY-ES0-1重组蛋白为抗原制备抗NY-ES0-1抗体，将抗NY-ES0-1抗体与胶乳微球偶联制备抗体 偶联物，然后将NY-ES0-1重组蛋白混合液a与外周血待测样品混合反应5-10min，最后再加 入抗体偶联物，检测546nm处吸光值，根据标准曲线获得样品中抗NY-ES0-1自身抗体浓度； 所述NY-ES0-1重组蛋白混合液a质量组成为：NY-ES0-1重组蛋白100-200ng/ml，35g/L聚乙 二醇-6000，牛血清白蛋白（BSA) 5g/L，0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶剂为pH6 · 8的缓冲 液;所述标准曲线按如下方法制备：用NY-ES0-1重组蛋白为抗原免疫家兔制备兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体，再将兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体按1000-62.5μg/ml梯度浓度用含体积 浓度0.1-1%牛血清白蛋白的缓冲液稀释成稀释液，以无抗体成份的含所述牛血清白蛋白 的缓冲液为空白对照，将兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体与胶乳微球偶联制备特异性抗体偶 联物，然后将NY-ES0-1重组蛋白混合液b与不同浓度稀释液混合反应5-10min，最后再加入 特异性抗体偶联物，分别测定546nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以稀释液中兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体浓度作为横坐标制作标准曲线;所述NY-ES0-1重组蛋白混合液b组成同NY-ES0-1重组蛋白混合液a (本发明所述NY-ES0-1重组蛋白混合液a、NY-ES0-1重组蛋白混合液 b均为NY-ES0-1重组蛋白混合液，为便于区分不同步骤用量不同而命名，字母本身没有含 义)。
[0008] 进一步，所述胶乳微球以直径为40-230M1，微球表面活化基团为-C00H或-NH2的质 量浓度10%胶乳液的形式加入，优选购自美国Bangs公司。
[0009] 进一步，所述抗体偶联物制备方法为：（1)胶乳微球活化：将胶乳微球与邱5.0_ 7.5、0.01-0.5mo 1 /L MES缓冲液(优选pH6.5、0.05mo 1 /L)、水、吐温-20混合，涡旋振荡混匀， 制得胶乳混合液；向所述的胶乳混合液中加入50mg/mL NHS水溶液和10mg/mL碳二亚胺水溶 液，涡旋振荡15-45分钟，再超声5-15次，每次超声5-10秒，间隔15-30秒，超声能量6000- 9000kJ(优选超声5次，每次超声10秒，间隔15秒，超声能量9000kJ);超声结束后混合液过 Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱，用水洗至终体积为最初使用胶乳体积的2倍，获得活化的胶 乳液;所述胶乳微球以直径40_230nm，微球表面活化基团为-COOH或-NH 2的10wt %胶乳液形 式加入;所述胶乳微球与所述的缓冲液体积比为0.4:1，所述水与所述的缓冲液体积比为 1.5:1，所述吐温-20与所述的缓冲液体积比为1-2:100(优选2:100);所述NHS水溶液与所述 的缓冲液体积比为1:10-20(优选1:16)，所述碳二亚胺水溶液与所述的缓冲液体积比为1: 10-20(优选1:16); (2)偶联:将抗NY-ES0-1抗体溶于pH7.4、100-200mM PBS缓冲液(优选 100mM)中制成抗体溶液，将抗体溶液与步骤(1)活化的胶乳液混匀后，于垂直混合仪反应ΙΑ小时 （优选 4h); 再加入 pH6 · 8-8 · 0 、 0 · 5-4 · Omo 1/L 甘氨酸缓冲溶液 (优选 pH7 · 4 、 lmo 1/L) 于 垂直混合仪混合10-60分钟(优选60min)，将反应液15000-30000rpm离心30-120分钟(优选 20000印111离心30分钟），弃上清，保留沉淀，用洗涤液重悬沉淀，15000-30000印1]1离心15-120 分钟(优选20000rpm离心30分钟），重复重悬和离心3-5次，取最后离心的沉淀即为抗体偶联 物;所述洗涤液是指含体积浓度〇. 1 %牛血清白蛋白的pH7.4、50-500mM甘氨酸缓冲溶液(优 选pH7.4、100mM);所述活化的胶乳液体积用量以抗NY-ES0-1抗体质量计为0.1-1.0ml/mg。
[0010] 进一步，所述标准曲线按如下方法制备：用NY-ES0-1重组蛋白为抗原免疫家兔制 备兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体，再将兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体用含体积浓度0.25 %牛 血清白蛋白的缓冲液稀释成lOOOμg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62 · 5μg/ml的稀释 液，以无抗体成份的含所述牛血清白蛋白的缓冲液为空白对照，将兔抗NY-ES0-1特异性IgG 抗体与胶乳微球偶联制备特异性抗体偶联物，然后将NY-ES0-1重组蛋白混合液b与不同浓 度稀释液混合反应5-10min，最后再加入特异性抗体偶联物，分别测定546nm处吸光值，以吸 光值为纵坐标，以兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体浓度作为横坐标制作标准曲线;所述重组蛋 白混合液b质量组成为:NY-ES0-1重组蛋白100-200ng/ml，35 g//L聚乙二醇-6000,牛血清白 蛋白 5g/L，0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶剂为pH6 · 8、50mM的 Tr i s-HCl 缓冲液。
[0011] 进一步，所述抗NY-ES0-1自身抗体为下列之一：抗NY-ES0-1自身抗体IgG、抗NY-ES0-1自身抗体IgA或抗NY-ES0-1自身抗体IgM，优选抗NY-ES0-1自身抗体IgG。
[0012]此外，本发明还提供一种外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法（即化学发光 法检测），所述方法:采用NY-ES0-1重组蛋白为包被抗原，加入待测样品，再加入抗人IgG抗 体直接与2 '，6 二甲基羰基苯基10-甲基-9-叮啶甲酸酯4 ' -N-琥珀酰亚胺酯三氟甲基磺酸 盐(简称吖啶酯DMAE-NHS) (CAS: 115853-74-2)偶联制备的标记抗体，加入底物液A和底物液 B进行发光反应，检测反应液发光强度，根据人抗NY-ES0-1 IgG抗体标准曲线，获得待测样品 中抗NY-ES0-1自身抗体浓度;所述底物液A组成为：质量浓度0.1 -0.25 %过氧化尿素、体积 浓度0.01 %Triton X-100，溶剂为 100mM、pH8.OTris缓冲液，底物液B组成为：100mM NaOH、 体积浓度2%的Triton X-100，溶剂为水;所述抗人IgG抗体与吖啶酯DMAE-NHS物质的量之 比为1:3-5;所述抗人IgG抗体为羊抗人IgG抗体或兔抗人IgG抗体;所述标准曲线按如下方 法制备：人抗NY-ES0-1 IgG抗体用含体积浓度0.25 %BSA的100mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液 稀释成 1 OOOμg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml 的稀释液，作为该化学发光检 测方法的校准品或标准品，以无抗体成份的含所述牛血清白蛋白的缓冲液为空白对照，用 NY-ES0-1重组蛋白为包被抗原，分别加入所述不同浓度校准品或标准品，再加入抗人IgG抗 体直接与吖啶酯DMAE-NHS偶联制备的标记抗体，加入底物液A和底物液B进行发光反应，检 测反应液发光强度，以人抗NY-ESO-11gG抗体浓度为横坐标，发光强度为纵坐标，绘制标准 曲线;所述底物液A和底物液B组成同待测样品检测所用底物液A和底物液B;所述人抗NY-ESO-1 IgG抗体制备方法为:收集抗NY-ES0-1自身IgG抗体阳性的人血清，用NY-ES0-1重组蛋 白-Sepharose 4B亲和层析柱纯化抗NY-ES0-1重组蛋白的特异性抗体，经蛋白质定量后稀 释。
[0013]进一步，优选过氧化尿素质量浓度0.1%。
[0014]胶乳免疫增强法反应原理为：首先用NY-ES0-1重组蛋白偶联胶乳微球，然后用该 偶联重组蛋白的胶乳微球与样本中的抗体发生结合，因凝集反应而出现浊度变化，可通过 检测浊度变化程度而推测样本中的自身抗体水平。
[0015] 胶乳免疫增强抑制法反应原理为:首先是样本中的抗体与过量添加的NY-ES0-1抗 原发生特异性结合，然后用抗ΝΥ-ESO-lIgG抗体偶联的胶乳微球来检测剩余游离的NY-ES0-1抗原。由于添加的NY-ES0-1抗原量是已知的，因此，可根据剩余游离的NY-ES0-1抗原量来 推测样本中的自身抗体水平。该反应模式为竞争抑制法，特异性较高。
[0016] ELISA和化学发光法检测样本中的抗NY-ES0-1自身抗体水平采用间接法。
[0017]本发明所述NY-ES0-1重组蛋白的制备为本领域公知方法，优选通过PCR方法将NY-ES0-1 DNA序列连接到原核/真核细胞表达载体，用E.coli DE3和/或HEK293或CH0细胞表 达、生产和纯化NY-ES0-1重组蛋白。
[0018] 本发明所述抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法，还可以将NY-ES0-1重组蛋白作为包 被抗原，以羊或兔抗人IgG抗体与辣根过氧化物酶或吖啶酯偶联物为示踪抗体，建立间接法 非均相的血清等体液中抗NY-ES0-1自身抗体检测方法。
[0019] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:本发明所述外周血中抗NY-ES0-1 自身抗体的检测方法可在生化分析仪和化学发光免疫分析仪等大型自动化仪器上进行大 样本自动化检测。本发明方法检测灵敏度1 -1 〇ng/mL。 (四）
【附图说明】
[0020] 图1为反应原理示意图，A为胶乳免疫增强法检测抗NY-ES0-1自身抗体原理示意 图，B为胶乳免疫增强抑制法检测抗NY-ES0-1自身抗体原理示意图，C为ELISA法检测抗NY-ES0-1自身抗体原理示意图，D为化学发光法检测抗NY-ES0-1自身抗体原理示意图；
[0021] 图2为反应标准曲线，A为胶乳免疫增强法检测抗NY-ES0-1自身抗体标准曲线，B为 胶乳免疫增强抑制法检测抗NY-ES0-1自身抗体标准曲线，C为ELISA法检测抗NY-ES0-1自身 抗体标准曲线，D为化学发光法检测抗NY-ES0-1自身抗体标准曲线。 (五)
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023] 实施例1
[0024] 1.NY-ES0-1重组蛋白制备
[0025] 1.1 NY-ESO-1 DNA 序列获得
[0026] 1.1.1从NY-ES0-1表达的肿瘤细胞中获取NY-ESO-1 DNA序列
[0027] 通过免疫印渍方法从肿瘤细胞中筛选NY-ES0-1阳性细胞株，2\106表达阶430-1 的肿瘤细胞(如A375黑色素瘤细胞和MCF7乳腺癌细胞系，本实施例选用A375黑色素瘤细胞） 用RNAeasy试剂盒(购自Qiagen)分离纯化总RNA，经Oligo dTi5引物(购自Takara)将总RNA逆 转录为cDNA，通过聚合酶链式反应(PCR)方法从中扩增获得NY-ES0-1 DNA序列（核苷酸序列 为SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列为SEQ ID从).2所示），0嫩测序验证。
[0028] 1.1.2 化学合成NY-ES0-1 DNA序列
[0029] 根据Genbank提供的NY-ES0-1 DNA序列（蛋白质ID:P78358)，委托商业公司进行化 学合成NY-ES0-1DNA序列（核苷酸序列为SEQIDN0.1所示，氨基酸序列为SEQIDN0.2所 示），并克隆至适当的克隆性载体(如pUC19，pUC57等，本实施例选择pUC57)。
[0030] 1 · 2通过原核细胞表达NY-ES0-1重组蛋白
[0031] 以步骤1.1获得的NY-ES0-1 DNA为模板，用聚合酶链式反应(PCR)将NY-ES0-1 DNA 开放阅读核苷酸序列(0RF)克隆到原核细胞表达载体pET15b或pET14b的Ndel/BamHI内切酶 位点，DNA测序验证后，转化Rosetta DE3大肠杆菌，挑选高表达NY-ES0-1的细菌克隆，扩大 培养至0D值到0.4-0.8时，用1. OmM IPTG在37 °C诱导4小时，lOOOOrpm离心15分钟收集细菌 沉淀。
[0032] NY-ES0-1复性和纯化：以处理150g细菌沉淀为例进行说明。将150g细菌沉淀加入 1.5L包涵体裂解液I(pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含ImM EDTA和100mM NaCl)后进行高压 超声破碎(压力l〇MPa，超声频率20000Hz，超声处理5min)，离心，沉淀用700ml包涵体裂解液 II(pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含ImM EDTA、100mM NaCl和0.5%Triton X-100)进行洗 涤，洗涤2次，lOOOOrpm离心10min，产生的沉淀用0.5M尿素（用pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液 含ImM EDTA、100mM NaCl配制）洗涤 1次，lOOOOrpm离心 10min。沉淀用200ml、8M尿素（用 pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含ImM EDTA、100mM NaCl配制）重悬，磁力搅拌30min后， lOOOOrpm离心 10min，上清（200ml)用pH 10.7，50mM K2HP〇4+lmM EDTA+50mM NaCl溶液稀释 10倍，用1M NaOH调ρΗ10·7后静置30min，再用2M HC1调pH至8.0，10000印111离心10111丨11，将上 清（2L)装入透析袋中进行复性透析。透析液为pH8.0，50mM Tr i s-HCl缓冲液含ImM EDTA、 lOOmM NaCl、10mM还原型谷胱甘肽、2mM氧化型谷胱甘肽和ImM二硫苏糖醇(DTThrC复性透 析48h，然后用pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含100mM NaCl进行透析，透析3次后过镍柱进行 纯化，洗脱液为PH8.0，50mM Na2HP〇4缓冲液内含150mM NaCl和300mM咪唑。进一步用AKTA纯 化重组蛋白峰，Lorry ' s酸试剂进行蛋白质定量。
[0033] 1.3真核细胞生产NY-ES0-1重组蛋白
[0034]以步骤1.1获得的NY-ES0-1 DNA为模板，克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(美国 Invitrogen公司），通过物理转染的方法（基因枪或脂质体）转染工程细胞CH0细胞（美国 ATCC公司），5%C0 2生物反应器中无血清培养液(美国Gibco公司)培养7-10天，收集上清液， 浓缩，用AKTA纯化重组蛋白峰。Lorry ' s?H式剂进行蛋白质定量。
[0035] 2.抗NY-ES0-1重组蛋白兔源性多克隆抗体制备方法
[0036] 2.1动物免疫
[0037] 以1.2或1.3制备的NY-ES0-1重组蛋白，以lmg/次/只NY-ES0-1重组蛋白与完全福 氏佐剂等体积混匀，家兔皮下多点注射免疫。每2周1次，连续5次，间隔1周后采用分离颈动 脉，收集血液约80-120毫升，室温放置2小时，4°C、10000rpm离心30min，分离收集血清。
[0038] 2.2抗体纯化
[0039] 先制备NY-ES0-1重组蛋白-Sepharose 4B亲和层析柱：取步骤1.2或1.3制备的无 游离氨基污染的高纯度(90%)NY-ES0-1重组蛋白25mg与溴化氢活化的Sepharose 4B 2g (购自Pharmacia)进行交联，按操作说明书进行交联，获得NY-ES0-1重组蛋白-Sepharose 4B亲和层析柱。然后上述血清(步骤2.1收集)用NY-ES0-1重组蛋白-Sepharose 4B亲和层析 柱纯化抗NY-ESO-1重组蛋白的特异性I gG型抗体，最后用8 % SDS-PAGE检测纯度，需达到 90%，获得兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体。将IgG用PBS稀释到〈lmg/ml，用紫外分光光度法进 行定量。IgG量(mg/ml) = ( 1 · 42 X 0D28Qnm-0 · 74 X 0D4Q3nm) X 稀释倍数。
[0040] 本实施例制备的抗NY-ES0-1多克隆抗体能与NY-ES0-1蛋白发生特异性结合反应， 而不与非NY-ES0-1蛋白发生非特异性反应。
[0041 ] 2.3兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体作为校准品或标准品
[0042]上述步骤2.2获得的兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体经蛋白质定量后用含体积浓度 0.25%85六的100111]\14!17.4的1^8-?：1缓冲液稀释成含兔抗阶450-1186抗体1000、500、 250、125、62.5以 8/!111不等的稀释液，作为该胶乳检测方法的校准品或标准品。
[0043] 上述步骤2.2获得的兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体经蛋白质定量后用含10%人血 清的100mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释成含兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体700、400、100μ g/ml不等的稀释液，作为该胶乳检测方法的质控品。
[0044] 2.4人抗NY-ES0-1自身抗体作为校准品或标准品
[0045] 收集抗NY-ES0-1自身IgG抗体阳性的血清100mL，用NY-ES0-1重组蛋白-Sepharose 4B亲和层析柱纯化抗NY-ES0-1重组蛋白的特异性抗体，最后用8 % SDS-PAGE检测纯度，需达 到90%，获得人抗NY-ES0-1自身抗体。Lorry's酸试剂进行蛋白质定量。经蛋白质定量后用 含体积浓度〇 . 25%BSA的100mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释成含抗NY-ES0-1自身抗体 1000、500、250、125、62.5μg/ml不等的稀释液，作为该胶乳检测方法的校准品或标准品。 [0046] 3.胶乳免疫增强法检测人血清等体液中抗NY-ES0-1自身循环抗体
[0047] 3.1胶乳免疫增强抑制法
[0048]胶乳微球交联兔源性多克隆IgG抗体，以活化交联4mL的1%胶乳-抗体为例进行说 明。
[0049] 3.1.1胶乳活化
[0050] 3.1.1.1 0.05mol/L MES缓冲液（pH6.5)lml，直径40-230nm，微球表面活化基团 为-C00H的10 %胶乳(美国Bangs公司）0.4ml，水2. lmL，20μ1吐温-20，涡旋振荡混匀。
[0051 ] 3· 1 丄 2加入50mg/mL NHS水溶液0· 25ml，10mg/mL碳二亚胺(EDAC)水溶液0 · 25mL， 祸旋振荡30分钟。
[0052] 3.1.1.3混合液超声5次，每次超声10秒，间隔15秒，超声能量90001^。过36?11 &(161 G-25葡聚糖凝胶柱(购自Pharmacia)，用水洗至终体积10-20ml，获得活化的胶乳液。
[0053] 3.1.2抗NY-ES0-1特异性IgG抗体与胶乳交联的优化
[0054] 3.1.2.1上述步骤3.1.1活化的胶乳液1.01111，分别与0.1，0.2,0.4,0.6,0.8，1.0， 1·2，1·4，1·6，1·8,2·Omg兔抗NY-ES0-1 特异性IgG抗体(分别溶于 1 ·0ml pH7·4，lOOmM PB缓 冲液中）混匀后，于垂直混合仪(宁波东芝医疗仪器公司）反应4小时。
[0055] 3.1.2.2分别加入1.0m〇l/L甘氨酸缓冲溶液(pH7.4) 1ml于垂直混合仪混合60分 钟，以封闭残留的活性基团，获得抗体-胶乳偶联液。
[0056] 3.1.3交联物的分离
[0057] 3.1.3.1上述步骤3.1.2.2制备的抗体-胶乳偶联液20000rpm离心30分钟，弃上清， 保留沉淀。
[0058] 3.1.3.2用洗涤液40ml重悬沉淀(洗涤液:pH7.4，100mM甘氨酸缓冲溶液内含0.1 % BSA)，20000rpm离心30分钟。
[0059] 3.1.3.3重复3.3.2步骤 3-5 次。
[0060] 3.1.4抗NY-ES0-1特异性IgG抗体与胶乳交联物的保存
[0061 ] 上述步骤3.1.3.3获得的胶乳沉淀中加入4ml含0.25 %BSA，0.3 % PVP，0.05 %NaN3 的pH7.4，500mM甘氨酸缓冲溶液，超声(9000J) 15秒混匀，4 °C保存。
[0062] 3.2胶乳免疫增强法
[0063] 胶乳微球交联NY-ES0-1重组蛋白，以活化交联4mL的1%胶乳-重组蛋白为例进行 说明。
[0064] 3.2.1胶乳活化
[0065] 3.2.1.1 0.05mol/L MES缓冲液（pH6.5)lml，直径80-400nm的 10%胶乳（美国 Bangs公司）0 · 4ml，水2 · lmL，吐温-20 20μ1，涡旋振荡混匀。
[0066] 3· 2 · 1 · 2加入50mg/mL NHS水溶液0· 25ml，10mg/mL碳二亚胺(EDAC)水溶液0 · 25mL， 祸旋振荡30分钟。
[0067] 3.2.1.3混合液超声5次，每次超声10秒，间隔15秒，超声能量9000kJ。过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱(购自Pharmacia)，用水洗至终体积10-20ml，获得活化的胶乳液。
[0068] 3.2.2 NY-ES0-1重组蛋白与胶乳交联的优化
[0069] 3.2.2.1上述步骤3.2.1活化的胶乳液1.01111，分别与0.1，0.2,0.4,0.6,0.8，1.0， 1 · 2，1 · 4，1 · 6，1 · 8，2 · Omg NY-ES0-1 重组蛋白（步骤3 · 1 · 4)(分别溶于 1 · 0ml pH7 · 4，100mM PB缓冲液中）混匀后，于垂直混合仪反应4小时。
[0070] 3 · 2 · 2 · 2分别加入5mol/L甘氨酸缓冲溶液(PH7 · 4) 1ml于垂直混合仪混合60分钟， 以封闭残留的活性基团，获得NY-ES0-1重组蛋白-胶乳混合液。
[0071] 3.2.3交联物的分离
[0072] 3.2.3.1上述步骤3.2.2.2获得的NY-ES0-1重组蛋白-胶乳混合液20000rpm离心30 分钟，弃上清，保留沉淀。
[0073] 3.2.3.2用洗涤液40ml重悬沉淀(洗涤液:pH7.4，500mM甘氨酸缓冲溶液内含0.1 % BSA)，20000rpm离心30分钟。
[0074] 3.2.3.3重复3.3.2步骤 3-5 次。
[0075] 3.2.4 NY-ES0-1重组蛋白与胶乳交联物的保存
[0076] 上述步骤3.2.3.3获得的胶乳沉淀中加入4ml含0.25 %BSA，0.3 % PVP，0.05 %NaN3 的pH7.4，1 OOmM甘氨酸缓冲溶液，超声15秒混匀，4 °C保存。
[0077] 3.3抗NY-ES0-1特异性IgG抗体/NY-ES0-1重组蛋白与胶乳交联最佳浓度的确定
[0078] 3.3.1主要试剂组成成分
[0079]胶乳免疫增强抑制法检测
[0080] 试剂R1:50mM，pH6.8的三羟甲基氨基甲烷(Tr i s-HCl)缓冲液中含：
[0081] PEG(MW 6000)35g/L;BSA 5g/L;NY-ES0-l重组蛋白 200 ng/mL;
[0082] Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05%。
[0083] 试剂R2:步骤3.1获得的交联抗NY-ES0-1特异性IgG抗体的胶乳微球。
[0084]胶乳免疫增强法检测
[0085] 试剂R1:50mM，pH6.8的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液含：
[0086] PEG(MW 6000)35g/L;BSA5g/L;Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05% 〇
[0087] 试剂R2:步骤3.2获得的交联NY-ES0-1重组蛋白的胶乳微球。
[0088] 3.3.2检测步骤
[0089] 反应类型：速率法温度:37Γ比色杯光径:0.6cm
[0090] 主/副波长：546nm/800nm单位:U/ml反应方向：上升
[0092] 3.3.3结果确定：
[0093] 计算校准品吸光度的差值(A校准-A空白），建立合适的数学模(非线性)如Logit-Log等，拟合成多点定标的校准曲线。根据各胶乳校准曲线的反应变化幅度、线性范围、相关 系数和反应可重复性，确定最佳的抗体与胶乳比例为：lmg抗体:0.1-1.0ml胶乳（10% );活 化的胶乳液体积用量以抗NY-ES0-1抗体质量计为0.1-1.0ml/mg。
[0094] 3.4外周血抗NY-ES0-1自身抗体检测
[0095] 3.4.1主要试剂组成成分
[0096]胶乳免疫增强抑制法
[0097] 试剂R1:50mM，pH6.8的三羟甲基氨基甲烷(Tr i s-HCl)缓冲液中含：
[0098] PEG(MW 6000)35g/L;BSA 5g/L;NY-ES0-l重组蛋白 200 ng/mL;
[0099] Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05%。
[0100] 试剂R2:步骤3.1获得的交联抗NY-ES0-1特异性IgG抗体的胶乳微球。
[0101]胶乳免疫增强法
[0102] 试剂R1:50mM，pH6.8的三羟甲基氨基甲烷(Tr i s-HCl)缓冲液含：
[0103] PEG(MW 6000)35g/L;BSA 5g/L;Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05% 〇
[0104] 试剂R2:步骤3.2获得的交联NY-ES0-1重组蛋白的胶乳微球。
[0105] 3.4.2检测步骤
[0106] 反应类型：固定时间2点法温度:37°C比色杯光径：1.0cm
[0107] 主/副波长:546nm/800nm单位:U/ml反应方向：上升
[0108]
3.4.3结果计算：
[0109]计算校准品吸光度的差值(A校准-A空白），建立合适的数学模(非线性)如Logit-Log 等，拟合成多点定标的校准曲线。根据样品 (A 样品-A 空白） 的吸光度差值，在工作曲线上 求得样品中抗NY-ES0-1抗体的含量，标准曲线见图2所示。
[0110]本实施例制备的胶乳免疫比浊法用于检测外周血或血清抗NY-ES0-1自身抗体水 平，当样品中含有NY-ES0-1时，交联特异性抗体或抗原的胶乳微球可由于抗原抗体特异性 结合发生凝集，造成浊度增加，通过测定样品吸光度变化，对照标准曲线，定量分析样品中 抗NY-ES0-1自身抗体含量，检测效能与酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫检测法接近 或等效。结果见表1所示。
[0111] 4.酶联免疫吸附法(ELISA)检测人血清等体液中抗NY-ES0-1自身抗体
[0112] 4.1生物素标记NY-ES0-1重组蛋白
[0113] 10mg NY-ES0-1重组蛋白（步骤1.1或1.2制备)溶解在lml 0.01M碳酸盐缓冲液中， 加入5mg NHS活化生物素，室温避光轻轻搅拌1-2小时后，装入透析袋中，4°C用0.15M pH7.4 PBS透析，换液4-6次后，10000-20000rpm离心15-30min去沉淀。加终浓度30 %甘油-20°C。
[0114] 生物素化NY-ES0-1重组蛋白最佳包被浓度确定。用50mM的碳酸盐缓冲液(CBS)稀 释链霉亲和素至l〇yg/mL后，以lOOyL/孔包被反应微孔4°C过夜或37°C 120min，用含0.05 % Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)或Tris-HCl缓冲液(PBS)洗涤3次，用10%小牛血清室温封 闭30min，再加入经用含0.05%Tween-20和5%小牛血清的磷酸盐缓冲液(PBS)或Tris-HCl 缓冲液(TBS)1:1000稀释的生物素化NY-ES0-1重组蛋白100μL7孔，室温反应30-60min，用含 0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)或Tris-HCl缓冲液(TBS)洗涤3次，加入含0.05% Tween-20和5%小牛血清的磷酸盐缓冲液(roS)或Tris-HCl缓冲液(TBS)1:3000稀释的兔抗 NY-ES0-1重组蛋白IgG抗体lOOyL/孔，室温反应30-60min，用含0.05 % Tween-20的磷酸盐缓 冲液(roS)或Tris-HCl缓冲液(PBS)洗涤3次，再加入lOOyL/孔的HRP标记羊抗兔IgG(美国 Jackson公司）室温反应15-30min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)或Tris-HCl 缓冲液(PBS)洗涤3次，最后加入四甲基联苯氨(TMB)底物显色观察。以出现明显蓝色反应孔 的最高稀释度孔为最佳稀释浓度。本发明发现生物素化NY-ES0-1重组蛋白最佳包被浓度以 lyg/mL为佳。
[0115] 4.2包被和封闭
[0116] 用50mM的碳酸盐缓冲液稀释NY-ES0-1重组蛋白至5yg/mL后，以100μL7孔包被反应 微孔，4°C过夜或37°C120min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)或Tris-HCl缓冲 液(TBS)洗涤3次，用10 %小牛血清室温封闭30min，甩干，可直接进行下一步操作，也可经充 分脱水干燥后，密封置4 °C可长期保存。
[0117] 采用生物素-亲和素体系时(步骤4.1)，用50mM的碳酸盐缓冲液稀释链霉亲和素至 l〇yg/mL后，以100μL7孔包被反应微孔，4°C过夜或37 °C 120min，用含0.05 % Tween-20的磷酸 盐缓冲液(PBS)或Tr i s-HCl缓冲液(TBS)洗涤3次，用10 %小牛血清室温封闭30min，甩干，经 充分干燥后，密封置4 °C可长期保存。
[0118] 4.3 加样
[0119] 加入100μL孔待检测血清样本，如定量时，则同时设立5个浓度为1000、500、250、 125、62.5以 8/!111人抗阶43〇-1标准品或校准品（步骤2.4)，室温或37°(：反应6〇1^11或4°(：过 夜。
[0120]如采用链霉亲和素包被反应微孔时，同时加入生物素标记的NY-ES0-1重组蛋白 (步骤4.1)，混匀。
[0121] 4.4加酶标抗体
[0122] 上述反应微孔用含0.05%了《6611-20的磷酸盐缓冲液（？83)或1^8-!1(：1缓冲液 (TBS)洗涤3次，最后再加入羊抗人酶标IgG抗体（购自美国Jackson公司），室温反应30-120min〇
[0123] 4.5 显色
[0124] 上述反应微孔用含0.05%了《6611-20的磷酸盐缓冲液（？83)或1^8-!1(：1缓冲液 (roS)洗涤3次，加入100μ1/孔四甲基联苯氨(TMB)或邻苯二氨(0PD)底物避光显色5-15min 观察。如定量时，则加入50μ1/孔的1.8M的盐酸或硫酸以终止反应。用酶标仪测各孔在450nm 或495nm处的吸光度0D值。
[0125] 4.6结果判定
[0126] 定性:凡出现明显蓝色或黄色反应者为阳性，否则为阴性。
[0127] 定量:根据抗NY-ES0-1标准孔的吸光度，绘制标准曲线，标准曲线见图2所示，计算 各样品孔的含量。结果见表1所示。
[0128] 5.化学发光免疫法检测人血清等体液中抗NY-ES0-1自身循环抗体
[0129] 5.1吖啶酯标记特异性抗体
[0130]采用直接标记法。1 Omg羊或兔抗人I gG抗体，以羊抗人I gG抗体为优先，分别溶解在 10ml 100mM，pH 9.0的碳酸盐缓冲液中与160μ1吖啶酯溶液（lmg 2'，6'_二甲基羰基苯基 10-甲基-9-吖啶甲酸酯4 ' -N-琥珀酰亚胺酯三氟甲基磺酸盐(简称吖啶酯DMAE-NHS) (CAS: 115853-74-2)溶于1.0ml二甲基甲酰胺中，B丫啶酯DMAE-NHS购自百灵威科技有限公司），羊 或兔抗人IgG抗体与吖啶酯DMAE-NHS摩尔比为1:4。轻轻搅拌混匀，室温避光轻轻搅拌3小 时。过Sephadex G-50凝胶柱(购自Pharmacia)，用pH 9.0、100mM磷酸盐缓冲液进行洗脱，收 集IgG峰，获得羊或兔抗人IgG抗体-[? 丫啶酯，即标记抗体。IgG量(mg/ml) = (OD280nm-0D4Q3nmX 0.3) X0.62。
[0131]吖啶酯标抗体最佳稀释浓度确定。用pH 9.6、50mM的碳酸盐缓冲液稀释人IgG抗原 (购自美国Jackson公司）至lyg/mL后，以100μL7孔包被反应微孔，4°C过夜或37°C放置 120min，用含体积浓度0.05 % Tween-20的pH 7.4、50mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用10 % 小牛血清室温封闭30min，再分别加入100μ1经含5%小牛血清的pH 7.4、50mM磷酸盐缓冲液 (PBS)以1:1000、1:2500、1:5000、1:10000、1:20000稀释的羊或兔抗人IgG抗体-叮啶酯室温 反应60min，用含0.05 % Tween-20的PBS(pH7.4、50mM)洗涤3次，加入含质量浓度0.1 %H2〇2的 0.1M NaOH溶液100μ1/孔，用罗氏E601化学发光免疫分析仪(美国Roche公司）测各孔发光强 度。以发光强度较高反应孔的最高稀释度孔为最佳稀释浓度。本发明发现以1:5000为佳。
[0132] 5.2包被和封闭
[0133] 用pH 9.6、50mM的碳酸盐缓冲液稀释NY-ES0-1重组蛋白至lyg/mL后，以lOOyL/孔 包被反应微孔，4°C过夜或37°C放置120min，用含体积浓度0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液 (PBS，pH 7.4、50mM)或pH 7.4Tris-HCl缓冲液（TBS)洗涤3次，用10%小牛血清室温封闭 30min，甩干，经充分干燥后，密封置4 °C可长期保存。
[0134] 采用生物素-亲和素体系时（步骤4.1 )，用pH 9.6、50mM的碳酸盐缓冲液稀释链霉 亲和素至l〇yg/mL后，以100μL7孔包被反应微孔，4°C过夜或37°C放置120min，用含体积浓度 0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH 7.4PBS)或Tris-HCl缓冲液(pH 7.4TBS)洗涤3次，用 10 %小牛血清室温封闭30min，甩干，经充分干燥后，密封置4°C可长期保存。
[0135] 5.3 加样
[0136] 加入lOOyL/孔待检测血清样本，如定量时，则同时设立步骤2.4制备的5个浓度为 1000、500、250、125、62.5以 8/1111人抗阶430-1自身抗体标准品或校准品，室温或37°(：反应 60min或4°C过夜。
[0137] 如采用链霉亲和素包被反应微孔时（步骤4.1)，同时加入lOOyL/孔生物素标记的 NY-ES0-1重组蛋白lμg/ml，混匀。
[0138] 5.4加叮啶酯标记抗体
[0139] 上述反应微孔用含体积浓度0.05%1>的11-20的磷酸盐缓冲液（？!17.4?85)或 Tris-HCl缓冲液(pH7.4TBS)洗涤3次，最后再加入经吖啶酯标记的羊或兔抗人IgG抗体100μ L/孔，室温反应60min。
[0140] 5.5增强发光
[0141] 上述各孔加入50yL底物液A(内含质量浓度0.1-0.25 %的过氧化尿素（以0.1 %为 好，过氧化尿素为美国Sigma公司产品）和体积浓度0.01 %的Triton X-100，溶剂为100mM， pH8.0的Tris缓冲液)和50yL底物液B(内含10mM NaOH和体积浓度2%的Triton X-100，溶剂 为水），混匀，立刻用罗氏E601化学发光免疫分析仪(美国Roche公司）测各孔发光强度。
[0142] 5.6结果判定
[0143] 定量:根据抗NY-ES0-1标准孔的发光强度，以步骤2.4制备的人抗NY-ES0-1抗体的 校正品浓度为横坐标，发光强度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线见图2所示，计算各样品 孔的含量。结果见表1所示。该方法灵敏度Ι-lOng/mL，与ELISA相关性r 2 = 0.97。
[0144] 表1临床血清样本用4种不同方法检测结果(单位:yg/mL)
[0145]
【主权项】
1. 一种外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述方法为：以NY-ESO-1重组蛋白为抗原制备抗NY-ES0-1抗体，将抗NY-ES0-1抗体与胶乳微球偶联制备抗体偶联 物，然后将NY-ES0-1重组蛋白混合液a与外周血待测样品混合，室温反应5-10min，最后再加 入抗体偶联物，检测546nm处吸光值，根据标准曲线获得外周血待测样品中抗NY-ES0-1自身 抗体浓度;所述NY-ES0-1重组蛋白混合液a质量组成为:NY-ES0-1重组蛋白100-200ng/ml， 35g/L聚乙二醇-6000，牛血清白蛋白 5g/L，0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶剂为pH6 · 8的 缓冲液;所述标准曲线按如下方法制备：用NY-ES0-1重组蛋白为抗原免疫家兔制备兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体，再将兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体分别按1000-62.5μg/ml梯度浓度 用含体积浓度〇. 1-1 %牛血清白蛋白的缓冲液稀释成稀释液，以含所述牛血清白蛋白缓冲 液为空白对照，将兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体与胶乳微球偶联制备特异性抗体偶联物，然 后将NY-ES0-1重组蛋白混合液b与不同梯度的稀释液混合，反应5-10min，最后再加入特异 性抗体偶联物，分别测定546nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以稀释液中兔抗NY-ES0-1特 异性抗体IgG浓度作为横坐标制作标准曲线；所述NY-ES0-1重组蛋白混合液b组成同NY-ES0-1重组蛋白混合液a。2. 如权利要求1所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述胶乳 微球以直径为40-230nm，微球表面活化基团为-C00H或-NH 2的质量浓度10%胶乳液的形式 加入。3. 如权利要求1所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述抗体 偶联物制备方法为：（1)胶乳微球活化:将胶乳微球与PH5.0-7.5、0.01-0.5mol/L MES缓冲 液、水、吐温-20混合，祸旋振荡混匀，制得胶乳混合液；向所述的胶乳混合液中加入50mg/mL NHS水溶液和10mg/mL碳二亚胺水溶液，涡旋振荡15-45分钟，再超声5-15次，每次超声5-10 秒，间隔15-30秒，超声能量6000-9000kJ;超声结束后混合液过Sephadex G-25葡聚糖凝胶 柱，用水洗至终体积为最初使用胶乳体积的2倍，获得活化的胶乳液;所述胶乳微球以直径 为40-230nm，微球表面活化基团为-C00H或-NH 2的质量浓度10 %胶乳液形式加入;所述胶乳 微球与缓冲液体积比为〇. 4:1，所述水与缓冲液体积比为1.5:1，所述吐温-20与所述缓冲液 体积比为1-2:100;所述NHS水溶液与所述缓冲液体积比为1:10-20，所述碳二亚胺水溶液与 所述缓冲液体积比为1:10-20; (2)偶联:将抗NY-ES0-1抗体溶于pH7.4、100-200mM PBS缓冲 液中制成抗体溶液，将抗体溶液与步骤（1)活化的胶乳液混匀后，于垂直混合仪反应1-4小 时;再加入PH6.8-8.0、0.5-4. Omol/L甘氨酸缓冲溶液于垂直混合仪混合10-60分钟，将反应 液15000-30000rpm离心30-120分钟，弃上清，保留沉淀，用洗涤液重悬沉淀，15000-30000rpm离心15-120分钟，重复重悬和离心3-5次，取最后离心的沉淀即为抗体偶联物;所 述洗涤液是指含体积浓度0.1 %牛血清白蛋白的pH7.4、50-500mM甘氨酸缓冲溶液;所述活 化的胶乳液体积用量以抗NY-ES0-1抗体质量计为0.1-1.0ml/mg。4. 如权利要求1所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述标准 曲线按如下方法制备：用NY-ES0-1重组蛋白为抗原免疫家兔制备兔抗NY-ES0-1特异性IgG 抗体，再将兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体用含体积浓度0.25 %牛血清白蛋白的缓冲液稀释 成 1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62 · 5μg/ml 的稀释液，以无抗体成份的含所述 的牛血清白蛋白缓冲液为空白对照，将兔抗NY-ES0-1特异性IgG抗体与胶乳微球偶联制备 特异性抗体偶联物，然后将NY-ES0-1重组蛋白混合液b与不同浓度稀释液混合反应5- lOmin，最后再加入特异性抗体偶联物，分别测定546nm处吸光值，以吸光值为纵坐标，以稀 释液中兔抗NY-ESO-1特异性IgG抗体浓度作为横坐标制作标准曲线;所述重组蛋白混合液b 质量组成为:NY-ESO-1重组蛋白100-200ng/ml，35g//L聚乙二醇-6000，牛血清白蛋白5g/L， 0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶剂为pH6 · 8、50mM的 Tr i s-HCl 缓冲液。5. 如权利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述抗NY-ES0-1自身抗体为下列之一：抗NY-ESO-1自身抗体IgG、抗NY-ESO-1自身抗体IgA或抗NY-ESO-1自身抗体IgM。6. 如权利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述抗体 偶联物与NY-ESO-1重组蛋白混合液a体积比为1:3,所述外周血待测样品与抗体偶联物体积 比为3:50。7. 如权利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述配制 NY-ESO-1重组蛋白混合液a的溶剂为pH6.8、50mM的Tr is-HCl缓冲液。8. 如权利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述稀释 兔抗NY-ESO-1特异性IgG抗体的缓冲液为pH6.8、50mM的Tris-HCl缓冲液。9. 一种外周血中抗NY-ESO-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述方法:采用NY-ESO-1重组蛋白为包被抗原，加入待测样品，再加入抗人IgG抗体直接与吖啶酯DMAE-NHS偶联制 备的标记抗体，加入底物液A和底物液B进行发光反应，检测反应液发光强度，根据人抗NY-ESO-1 IgG抗体标准曲线，获得待测样品中抗NY-ESO-1自身抗体浓度;所述抗人IgG抗体与吖 啶酯DMAE-NHS物质的量之比为1:3-5;所述抗人IgG抗体为羊抗人IgG抗体或兔抗人IgG抗 体;所述底物液A组成为:质量浓度0.1-0.25 %过氧化尿素、体积浓度0.01 % Triton X-100， 溶剂为100mM、pH8.0Tris缓冲液，底物液B组成为：10mM NaOH、体积浓度2%的Triton X-100，溶剂为水;所述人抗NY-ESO-1 IgG抗体标准曲线制备方法为：人抗NY-ESO-1 IgG抗体用 含体积浓度〇. 25%牛血清白蛋白的100mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释成1000μg/ml、500μ g/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml的稀释液，以无抗体成份的含所述牛血清白蛋白的缓 冲液为空白对照，用NY-ES0-1重组蛋白为包被抗原，分别加入所述稀释液，再加入抗人IgG 抗体直接与吖啶酯DMAE-NHS偶联制备的标记抗体，加入底物液A和底物液B进行发光反应， 检测反应液发光强度，以稀释液中人抗NY-ESO-lIgG抗体浓度为横坐标，发光强度为纵坐 标，绘制标准曲线;所述底物液A和底物液B组成同待测样品检测所用底物液A和底物液B。10. 如权利要求9所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗体的检测方法，其特征在于所述过氧 化尿素质量浓度为〇. 1 %。
【文档编号】G01N33/68GK105866433SQ201610319075
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】朱永良, 潘天慧, 黄建, 杨赛赛
【申请人】浙江大学