一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物工程领域，具体涉及一种体外刺激外周血YsT细胞高效增 殖的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 过继细胞免疫治疗是癌症治疗的一种强有力的手段，该治疗采用体外方法大量扩 增T细胞。"快速扩增程序（REP)"是一种生产出大量的T淋巴细胞行之有效且常规使用的 方法。快速扩增程序是一种抗原非依赖性的方案，该方案采用过量的致死剂量伽玛辐照异 体外周血单个核细胞（PBMC)作为饲养层细胞，同时使用抗CD3抗体（0KT3)和外源重组人 白细胞介素（rhIL)-2。白细胞介素-2是一种T细胞增殖和生长所需的强有力的T细胞有丝 分裂原。外周血表达Fc-yl受体（FcyRI)，它可以与抗⑶3抗体免疫球蛋白（Ig)的Fc段 相互作用。作为一种抗⑶3抗体，0KT3可绑定到T细胞表面的T细胞受体（TCR)-⑶3-复 合物上。抗⑶3-T细胞受体交联以及通过绑定到⑶3的抗体Fc而产生的T细胞和外周血 单个核细胞之间的相互作用，可同时提供信号1和共刺激信号-2,导致T细胞增殖而不会引 发无能或早期凋亡。这种快速扩增程序可以致使T淋巴细胞在14天内扩增1000倍。
[0003] 虽然快速扩增程序是一种常用的方法，但它的应用受到材料和技术上的限制。在 临床应用快速扩增程序时，一个T细胞中通常会用200个外周血单核细胞来刺激。所以快 速扩增程序需要用血细胞分离机大容量白细胞单采术从多个健康的捐助者收集大量异体 外周血单个核细胞。快速扩增方案中所收集的外周血单个核细胞来自异体，需要经过大量 的实验室检测，以确认处于无菌状态，这可能既昂贵又费时。由于外周血单个核细胞来自于 多个捐助者，收集而来的外周血单个核细胞对T细胞扩增的维持作用在捐助者个体间可能 会表现出很大的差异性。所有这些问题都会对大型多中心随机临床试验有所妨碍。
[0004] 为了克服以上快速扩增程序的问题，基因工程改造过的人类红白血病细胞株K562 细胞已经被用来取代外周血单个核细胞。K562细胞本身既不表达内源性的HLAII类分 子（因此减少了同种异体反应），也不表达诸如CD86、CD83、4-1BBL、0X40L、IC0SL(B7H2， B7RP1)或CD40L等共刺激分子。K562细胞也不表达抑制分子，如H)L1 (B7H1)，PDL2 (B7DC)， B7H3和B7H4 (B7X，B7S1)。在三种人类IgGFc受体中，K562细胞内源性高表达CD32,而CD16 或⑶64并不会高表达。K562细胞表达黏附分子⑶54 (ICAM-1)和⑶58 (LFA-3)，这会增强 K562细胞与T细胞间的相互作用并提高T细胞的增值效率。基因工程改造K562很容易进 行，转基因在改建后的K562细胞中的表达比较稳定。多项临床试验已证实使用K562为饲 养层细胞进行T细胞扩增是一种安全可靠的方法。
[0005] 绝大多数T淋巴细胞属于a0T细胞。它们的T细胞受体由a和0链组成。一 个小部分T淋巴细胞表达T细胞受体gamma和delta异二聚体（yS)链。yST细胞在肿 瘤和感染的免疫监视方面起到重要作用。YST细胞能够渗入人体实体肿瘤内部，影响肿 瘤生长并且杀死癌细胞。能被YST细胞渗入实体肿瘤包括肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结直肠 癌、乳腺癌和鼻咽癌。Vy9VS2T细胞是人类外周血yST细胞的主要亚群，几个早期阶段 的过继免疫治疗癌症的临床试验已经使用了Vy9Vs2T细胞。
[0006]Vy9VS2T细胞只占外周血T细胞一小部分，大约0.5-5%。为了有足够量的 Vy9VS2T细胞进行过继细胞免疫治疗，病人往往需要经过大容量白细胞单采术来收集 大量外周血单核细胞。单采术技术可收集1X109个外周血单个核细胞，生产几十亿的 Vy9VS2T细胞用于多次注射。IPP(异戊烯焦磷酸）是人类yST细胞Vy9VS2亚群的 天然抗原，已用于yST细胞的扩增。异戊烯焦磷酸的合成类似物溴醇焦磷酸（BrHPP)及 双膦酸盐唑来膦酸（Zometa)也可以选择性地激活扩增人类Vy9VS2T细胞。这些化合物 现在已广泛用于Vy9VS2T细胞的体外扩增。唑来膦酸是美国食品和药物管理局批准的， 市场上可以买到的治疗绝经后骨质疏松症的双膦酸盐药物。这种药物抑制法尼基焦磷酸合 酶（FPP)，该酶在甲羟戊酸通路中的异戊烯焦磷酸下游发挥作用，因此可以增加细胞内的异 戊烯焦磷酸的水平。
[0007] 在本发明将K562细胞进行遗传修饰从而产生可应用于大规模扩增YST细胞的 饲养层细胞。经过遗传修饰的K562细胞稳定表达CD64高亲和力Fc受体基因，共刺激分子 ⑶86,和共刺激分子⑶137L基因（4-1BBL)。⑶137L是4-1BB受体的配体，主要表达在活化 的T细胞表面上。⑶137信号转导参与抑制激活诱导性细胞死亡，与⑶4+T细胞相比，这会 有利于⑶8+T细胞的扩增。⑶137也会增强记忆型⑶8T细胞的发育。⑶86是⑶28共刺激 受体的配体，而⑶28在静息和激活的T细胞中均有表达。通过⑶64与0KT3抗⑶3单克隆 抗体的Fc部分相互作用，第一信号（0KT3-⑶3)以及⑶86-⑶28和⑶137L-⑶137共刺激信 号会双信号同时刺激T淋巴细胞。K562细胞饲养层细胞已用于a0T细胞扩增，但它们对 Vy9VS2T细胞的扩增能力尚待确定。
【发明内容】
[0008] 为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中Vy9Vs2T细胞的扩增能 力差，抗肿瘤细胞毒性差的技术瓶颈，从而提出一种扩增能力高并且，具备完整的抗肿瘤细 胞毒性，可杀死实体肿瘤细胞和非实体肿瘤细胞的体外刺激外周血YST细胞高效增殖的 方法。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明公开了一种体外刺激外周血yST细胞高效增殖的 方法，所述方法为：
[0010] 1)将目的基因⑶64,⑶86,和⑶137L插入到K562细胞的基因座中得到单克隆细 胞株；
[0011] 2)从外周血中分离单个核细胞，并用唑来膦酸和白细胞介素-2预处理外周血单 个核细胞；
[0012] 3)预处理过的外周血单个核细胞与遗传修饰过的K562细胞共同培养，并加入 0KT3抗体和白细胞介素-2。
[0013] 优选的，所述的体外刺激外周血yST细胞高效增殖的方法，其中，所述基因座为 人类第19号染色体AAVS1基因座。
[0014] 优选的，所述的体外刺激外周血YsT细胞高效增殖的方法，其中，所述方法的步 骤1)的具体步骤为：采用锌指核酸酶技术，以位点特异性的方式引导将目的基因插入到K562细胞人类第19号染色体AAVS1基因座；然后用嘌呤霉素对改造后的K562细胞进行筛 选，以获得单克隆细胞株；最后用流式细胞仪分析筛选得到的高表达目的基因的单细胞克 隆株。
[0015] 优选的，所述的体外刺激外周血yST细胞高效增殖的方法，其中，所述方法的步 骤2)的具体步骤为：先用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法从白细胞层将外周血单个 核细胞分离出来。再将外周血单个核细胞种植到孔板中，使用A頂-V培养基，并加入唑来膦 酸和人类重组白细胞介素-2刺激外周血单个核细胞。
[0016] 更为优选的，所述的体外刺激外周血yST细胞高效增殖的方法，其中，所述唑来 膦酸为5yM;所述0KT3抗体为50ng/ml。
[0017] 优选的，所述的体外刺激外周血yST细胞高效增殖的方法，其中，所述人类重组 白细胞介素-2为300IU/ml;外周血单个核细胞的密度2X106/ml。
[0018] 进一步的，所述的体外刺激外周血yST细胞高效增殖的方法，其中，所述方法的 步骤3)的具体步骤为：当细胞激活并扩增后，用修饰过的K562细胞，0KT3抗体，白细胞介 素2和唑来膦酸混合物共培养细胞，进行yST细胞扩增；共培养时添加0KT3抗体，重组人 白细胞介素-2和唑来膦酸促进yST细胞进一步增殖。
[0019]更为进一步的，所述的体外刺激外周血yST细胞高效增殖的方法，其中，所述K562细胞扩增使用前先经y辐照或与混有丝裂霉素C处理灭活。
[0020] 本发明还公开了任一所述的体外