一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞egfr的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测EGFR的新方法，尤其是检测晚期结直肠癌患者外周血循环肿 瘤细胞EGFR的方法。
【背景技术】
[0002] 晚期结直肠癌患者，靶向联合化疗可以明显延长晚期结直肠癌无病无进展生存期 和总生存期。晚期结直肠癌患者临床目前应用的靶向药物中。西妥西单抗是一种靶向EGFR 的IgGl单克隆抗体，已在临床上应用，并取得一定疗效。
[0003] EGFR是配体激活受体酪氨酸激酶erB-B家族成员之一，其参与肠黏膜的生长、增殖 和再生，并在结直肠癌的发展过程中起着至关重要的作用。在50%-85%的结直肠癌标本中 EGFR呈阳性表达，并且其表达程度与临床分期、有无淋巴结转移、无病生存期、总生存期、5 年复发率等密切相关。
[0004] 人EGF受体（human epidermal growth factor receptor，HER)家族由4个成员组 成，分别称为HER1 (EGF erbB)、HER2 (Neu/erbB2)、HER3 (erbB3)和HER4 (erbB4)，均属于I 型 酪氨酸激酶受体基因家族。其蛋白质结构可以分为3个区域:细胞表面的配体结合区、跨膜 区和细胞内的酪氨酸激酶区。EGFR在缺乏特异性配体时以单体形式存在，但与配体结合后 发生聚合。二聚体形式改变了蛋白质构象，导致酪氨酸激酶活化和受体自身磷酸化，后者通 过JAK-STAT和PI 3K-Akt等转导途径将信号传递到细胞核内，从而促进细胞增殖，血管生成、 转移和抑制细胞凋亡。EGFR与恶性细胞的生长有关，激活EGFR可以促进肿瘤的生长和进展。
[0005] 目前常用的EGFR检测方法为免疫组织化学方法，通过检测结直肠癌组织标本中的 EGFR蛋白表达情况判定EGFR状态。免疫组化法是以肿瘤组织为检测对象，而对于晚期无法 获取组织标本的结直肠癌患者，EGFR表达状态评估变得困难。
【发明内容】
[0006] 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落进入外周血液 循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检 测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的 个体化治疗具有重要的临床意义。因 CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的"液 态活检"。
[0007] 研究表明，外周血循环肿瘤细胞与原发瘤细胞活性存在一定的一致性。目前对于 晚期无法获得临床标本结直肠癌患者的治疗仍采用经验用药，为了避免无法获取组织标本 的晚期结直肠癌患者无法检测EGFR表达，进而不能评估患者EGFR状态的不足，本发明提供 了一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法:利用膜过滤装置分离获得 无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片， 进而检测无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况。
[0008] 本发明采用的技术方案如下：
[0009] -、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的 CTC：
[0010] 1、采集晚期结直肠癌患者外周血:肘正中静脉血5ml;
[0011] 2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：lmmol/lEDTA+ 0.1%BSA，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%;
[0012] 3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞： 将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过 滤；
[0013] 4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A 液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净;滤液过滤完全后加入B液，lml，染色 2min，纯水lml，冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存 在 CTC。
[0014] 二、运用细胞蜡块技术制作薄层切片：
[0015] 1、脱色:将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC 染色液，所述脱色液为:95 %酒精与100 %二甲苯按容积比1:1混匀。
[0016] 2、包裹:浸泡结束后取出滤膜，用显微镜擦镜纸或滤纸包裹；
[0017] 3、固定:将包裹物置于10%中性福尔马林中，固定4-6h;
[0018] 4、浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细 胞石蜡块；
[0019] 5、薄层切片:用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μπι的薄层切片。
[0020] 三、检测晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况：
[0021] 1、将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化:二甲苯溶液浸泡3 次，每次10分钟;无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟;95 %乙醇溶液浸泡5分钟;85 %乙醇溶 液浸泡5分钟；75 %乙醇溶液浸泡5分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟;ΡΗ = 7.4的PBS浸泡3 次，每次3分钟。
[0022] 2、采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复:取ρΗ = 6.0柠檬 酸盐缓冲液800_1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐 高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，喷汽1-2分 钟后，压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH = 7.2-7.4 的PBS冲洗两次，每次各3分钟；
[0023] 3、3%H2〇2去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，每次3分 钟；
[0024] 4、滴加 EGFR-抗，室温或37 °C孵育1-2小时或4°C过夜，PBS冲洗3次，每次5分钟；
[0025] 5、滴加通用型生物素化二抗，室温或37 °C孵育60分钟，PBS冲洗3次，每次2分钟；
[0026] 6、应用DAB溶液显色：甩去roS液，每张切片加2滴或100μΙ新鲜配制的DAB溶液，显 微镜下观察5-10分钟；
[0027] 7、蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片:蒸馏水冲洗2次，每次3分钟;苏木素复染1分 钟;0.1 %盐酸酒精分化;0.1 %氨水溶液返蓝;50 %、70 %、85 %、95 %、无水乙醇脱水干燥； 二甲苯透明，中性树脂胶封片；
[0028] 8、细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定EGFR表达情况。
[0029] 步骤中所述的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台， 所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的 下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。
[0030] 所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上； 滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。
[0031 ]所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔。
[0032] 本发明的有益效果是:通过该技术方法，不用结直肠癌组织即可检测到无法获取 组织标本的晚期结直肠癌患者EGFR表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；
[0034] 图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；
[0035] 图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；
[0036] 图4为晚期结直肠癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；
[0037] 图5为晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR免疫组化染色图像。
[0038]图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜 平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合附图和实施例对本发明阐述如下。
[0040] 运用此技术方法分离获取并鉴定8例晚期结直肠癌患者（同时检测8例正常人样本 做阴性对照)外周血循环肿瘤细胞的实施例。
[0041] -、利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血中的 CTC：
[0042] 采集各样本外周血5ml，用45ml稀释液（成分：lmmol/l EDTA+0.1%BSA)稀释外周 血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀释后的血样10分钟。
[0043] 在固定的间期，组装膜过滤装置：如附图1、图2、图3所示，该过滤装置由滤器3、滤 膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成。用lOmlPBS润湿滤器3,然后将固定好的外周血样加 入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤，CTC被截留在滤膜7上。
[0044] 肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞(包括红细胞、白细胞)直径一般小于10 微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔能够被滤过，而CTC因直径 大于滤孔被截留在滤膜上。
[0045]过滤结束后，从过滤装置中取下滤器3，打开并移走滤器上口 6，将循环肿瘤细胞染 色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲