一种人外周血循环肿瘤DNA中septin 9基因甲基化的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种人外周血循环肿瘤DNA中septin9基因 甲基化的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是在世界范围内导致人类死亡的重大疾病之一。在欧洲和美国的癌症新 发病中结直肠癌分别排在第二和第Ξ，欧洲2012年结直肠癌新发病例约为447000人，死亡 病例约为215000人，美国2013年新发病例约为142820人，死亡病例约为50830人.而在 中国，结直肠癌在2012年的新发病例约为400000人，已成为中国人发病率及死亡率第Ξ高 的疾病。
[0003] 通过常规筛查可实现结直肠癌的早期检测，进而进行早期治疗来阻止病程进展甚 至治愈。但现状是60% -70%的结直肠癌患者是在中期或者晚期才被诊断发现，只有接近 40%的患者是在早期被发现的。来自USPSTF(USPreventiveServicesTaskF'orceodic) 的数据显示通过定期的筛查可避免近60%因结直肠癌导致的死亡，且结直肠癌患者的5年 生存率也将由46%提升至73%。因此一种有效的结直肠癌早期筛查方法将提高患者的5 年生存率，降低死亡率。
[0004] 目前主要有便潜血实验（F0BT[愈创木脂法（评0BT)和免疫化学法（iFOBT)])、结 直肠镜两种结直肠癌筛查方法。作为一种常规的筛查方法，愈创木脂法便潜血实验（评0BT) 会因饮食，药物和其他因素的影响而导致假阳性，因而影响检测的稳定性。免疫化学法便 潜血实验（iFOBT)在敏感性和特异性上比传统的愈创木脂法便潜血实验（评0BT)表现要 优越，但大多数临床实验室进行的iFOBT还是定性的而且如果样本从捜集到检测之间超过 5天，其检出率将大大降低。相比之下，结直肠镜是一种侵入式的检测并且在检测前需要相 应的肠道准备W确保大肠腔内满意的视野。其还有可能引起如消化道出血、肠穿孔和感染 等并发症。而且患有严重屯、脏病、屯、肺功能障碍、急性腹泻、严重溃瘍性结肠炎、克罗恩病、 腹膜炎等疾病的患者及孕妇不能进行结直肠镜检查。因此不论是便潜血实验或是结直肠镜 都存在患者依从性不好的问题。在美国便潜血实验的筛查率仅为1〇%，2008年50岁W上 人群结直肠镜筛查率为50.2%。而在中国，便潜血实验和结直肠镜的筛查率分别预计不足 5%和3%。由于传统发的结直肠癌筛查方法存在低效性或侵入性，所W现急需一种更加方 便，更加精确的筛查方法来提高结直肠癌的筛查率。
[00化]最近，基于血液的结直肠癌检测-SEPT9基因甲基化检测有望应用于临床筛查。多 个临床试验发现甲基化的SEPT9基因是结直肠癌早期检测的特异的生物标记。在结直肠癌 早期，SEPT9基因被超甲基化，其DNA被坏死或调亡的肿瘤细胞释放到外周血中。可通过检 测受检者的外周血中SEPT9基因甲基化的程度来判断其患结直肠癌的风险。循环DNA被发 现于人类外周血清中，且其在风湿、肿瘤等多种疾病中的含量会急剧增加。甲基化的DNA同 样也被发现存在于人类血清中。Lofton-Day及其同事在结直肠癌患者和健康对照人群的血 样中测试了 3个DM甲基化生物标记。沈PT9被证明是特异性最好的候选标记。随后，多个 病例对照研究证实了SEPT9可作为结直肠癌检测的甲基化生物标记。在运些病例对照研究 中SEPT9检测的敏感性和特异性分别为67-79. 3%和86-99%。运些研究证明了沈PT9检 测是一种精确，合适，快速W及微创的结直肠癌检测方法。
[0006] DNA甲基化是一个在胞喀晚或腺嚷岭上添加一个甲基基团的生化过程，它在细胞 由干细胞分裂、分化为特异组织时改变基因的转录和表达。细胞中的基因甲基化结果通常 是永久及单向的，W防止细胞恢复为干细胞或转变为其他类型组织。DNA的甲基化通常在受 精卵形成时被去处掉W达到生殖细胞重编程过程中的表观遗传学沉默进而保持基因组完 整性，而在发育过程中细胞连续分裂时又重新建立。运种DNA甲基化的重建是一种独立于 经典的孟德尔遗传定律的遗传过程，使特定的基因W亲源特异的方式表达。运种过程被称 作基因组印记。除了基因组印记之外，DNA甲基化还是哺乳动物正常发育中很多其他遗传 过程的重要组成部分，例如：X染色体失活、重复元素的抑制等。
[0007] DNA甲基化主要发生在CpG位点。哺乳动物中60% -90%的CpG位点是呈甲基化 状态的。未甲基化的CpG位点经常成簇的存在，运些成簇的CpG位点被称作CpG岛。而CpG 岛则常存在于很多基因的5'调控区，特别是启动子区。在癌症患者中，启动子区高度甲基 化的基因的转录被沉默，DNA甲基化的逐渐累积还将导致长期基因沉默。DNA甲基化通过两 种方式抑制基因的转录。第一种，某基因转录因子的结合可能被DNA甲基化阻断。第二种， 甲基化的DNA可能与甲基-CpG-结合域蛋白（M抓S)相结合来招募其他蛋白至其位点，如组 蛋白去乙酷化酶和其他染色质重塑蛋白，形成致密、失活的染色质（异染色质）。
[0008] DNA甲基化是癌症发展的重要要素，它与众多恶性肿瘤相关。在癌症中存在着低甲 基化和超甲基化两种形式，他们在癌症发生机制中扮演着不同的角色。异常的超甲基化经 常发生在基因的启动子区的CpG岛，它可导致抑癌基因的转录沉默或失活。相反地，低甲基 化则与染色体不稳定和失去遗传印记相关。DNA甲基化对胚胎发育和体细胞分裂都有重要 意义，因为甲基化状态基本上会高保真的传递给子细胞。
[0009] Septin家族是真核生物中一组高度保守的GTP结合蛋白。它们是一些骨架蛋白， 在细胞分裂和区隔化中起到结构支撑的作用。在人类中共有13种septin基因。所有的 septin家族成员可W形成异源复合物并进一步形成高级结构，如：纤丝、笼状复合物等。运 些独特的结构是细胞分裂中细胞进程控制所需要的。最近有研究表明，在人类中，septin蛋 白可W在病原细菌周围形成笼状结构W固定有害微生物、防止它们侵入其他细胞。
[0010] SEPT9基因定位于染色体17q25. 3位置。该基因有18种转录本，编码15个多肤。 其在肌动蛋白动态、血管生成、细胞运动、细胞增殖、细胞形状、胞质分裂、微管调控、胞外分 泌等生理活动中扮演着重要的角色。最近有研究指出，该基因与乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、 头颈癌、白血病和淋己瘤等的发生紧密相关，还可能是唐氏综合症，遗传性神经痛性肌萎 缩、和细菌感染的致病因素。在小鼠胚胎中敲除该基因是致死的。
[0011] Septin家族的各成员存在于稳定的6-8亚基核屯、异聚体中，该类型异聚体中均包 含SEPT2、SEPT6和SEPT7亚基。由6个W上亚基组成的异聚体中还包含SEPT9。最近有研 究指出SEPT9占据了八聚体复合物的末端，在亚基的聚合中起到了关键作用，进而使异聚 体更稳定。其在胞浆运动中对子细胞的分离也很重要。因此，胞浆运动可能因SEPT9的异常 表达或不表达而受到严重影响。当SEPT9基因被超甲基化而转录受到抑制时，其在septin 复合物中的重要作用的丧失可能是结直肠癌发生机制的关键因素。
[0012]SEPT9在肿瘤发生机制中的作用首次发现于混合性淋己瘤中，研究表明混合性淋 己瘤的原癌基因是SEPT9与其他基因的融合。乳腺癌、卵巢癌的杂合丧失现象中的常见区 域中也有SEPT9基因，运说明该基因是一个可能的肿瘤抑制基因。在一些肿瘤细胞系中 SEPT9的V4转录本的表达缺失或减弱，并可通过5-氮杂胞巧处理而重新获得活性，运一发 现也证实了上述观点。更进一步的，SEPT9_V2转录本的启动子区的DNA超甲基化化及该基 因的表达下调均导致结直肠癌的发生，也说明该基因是一个抑癌基因。人们在结直肠活检 组织、激光显微切割上皮细胞和基质中发现SEPT9基因的mRNA表达量在从腺瘤到异型增生 到癌的进展过程中逐步下降，且与正常对照相比，其在结直肠癌中的表达显著下调。沈PT9 的超甲基化与结直肠癌中失去其mRNA表达的显著相关性表明SEPT9的表达下调可能可W 解释结直肠癌从良性到恶性病变的病理进程。不过，也有一些研究发现在乳腺癌、前列腺 癌、卵巢癌和肝癌组织中SEPT9某些亚型是过表达的。与结直肠癌中相反，运些发现表明某 些特定的SEPT9转录本是致癌基因。例如，在卵巢癌中存在多种SEPT9基因亚型的表达，并 且各不同亚型的表达呈现组织特异性。沈PT9的运些截然相反的作用说明在不同肿瘤中 DNA甲基化状态的变化可能是一种常见的现象，DNA甲基化是调节不同SEPT9亚型表达的固 有的机制。
[0013] 最近研究表明，结直肠腺瘤和癌组织中沈PT9_V2转录本的主要的甲基化状态变 化仅限于发生在第SCpG岛（CGI3)运一个CpG岛上。该区域包含SEPT9_V2转录本的启动