检测leber氏致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分子生物学技术领域，设及检测LEBER氏致病基因突变的方法，及其引 物、试剂盒。
【背景技术】
[0002] LEBER氏（Leberhereditaryopticneuroretinopathy)是一种遗传性视神经病， 现有的检测L邸邸氏的致病基因技术包括：突变特异性引物PCR检测、异源双链-单链构象 多态性、限制性片段长度多态性和测序方法。主要是基于单个突变位点的PCR和测序方法 及单基因忍片方法，显著缺点主要在于仅仅能检测单个突变位点，不能对多个突变位点进 行同时检测，也不能对分布于多个外显子的位点进行同时检测。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测LEBER氏致病基因突变的方法， 其解决了现有技术中进行LEBER氏致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和 灵敏度低等问题。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测LEBER氏致病基因突变 的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：
[0005] 样本处理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0006]DNA提取，取220μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0007] 1)加220μ1BufferBL，震荡混合，于70°C解育10分钟；
[000引。加220μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0009] 3) 12000巧m离屯、1 分钟；
[0010] 4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0011] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500 μ 1皿solution,室溫放置5分钟；
[0012] 6)12000巧m离屯、2分钟；
[0013] 7)加入 700μ1 wash Buffer, 12000巧m离屯、2 分钟；
[0014] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700 μ 1 wash Buffer, 12000巧m离屯、2分 钟；
[001引 9)弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0016] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[0017]PCR扩增
[001引PCR反应体系：
[0019] 10XPCRBuffer2μ1；
[0020] HotStarTaq DNA Polymerase按kit标准调整；
[00引]dNTPmix2";
[0022]上游引物PrimerU1μ1 ;
[0023]下游引物PrimerL1μ1 ;
[0024] DM模板Xμ1 ;
[00巧]灭菌蒸馈水20μ1---上述总体积；
[0026] PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0027] PCR产物纯化
[0028] 每管内加入100μ1PCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000巧m离屯、2min;
[0029]弃收集管内液体，加入 700μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[0030]弃收集管内液体，加入 400μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[003。弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[003引柱内加入30μ1 70°C预热洗脱液，12000巧m离屯、3min;
[0033] 测序反应
[0034]反应体系：0. 8μ1Bi曲ye+1.5ylBi曲yeSeqBuffer+3yl引物+1μ1PCR纯 化产物 +3. 5μ1dd&0 ;
[0035] 测序PCR热循环条件：
[0036] 1)变性的条件，96°ClOsec;
[0037] 5)退火的条件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25个循环；
[0038] 6)延伸的条件，60°C4min;
[0039] 7)4°C保溫；
[0040] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算；
[0041] 测序产物纯化
[0042] 10μ1反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0043] 1)每管加入100μΙ100%酒精，或每管加入1μ1 125mM邸TA到管底，或每管加 入1μ1 3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室溫放置15min;
[0044] 2) 10°C，4000巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[0045] 3)每管加入100μl70%酒精，离屯、15min;5°C，3600巧m离屯、30min，马上倒置， 1200巧m离屯、Imin;
[0046] 4)室溫挥发净酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DM;
[0047] 5) 95°C变性 5min，4°C保溫 4min，加样上机；
[0048]6)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[004引 PCR检测，包括：
[0050]1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔.
[0051] 在LE邸R氏基因突变位点两端设计Ξ对特异性引物；
[0052]所述引物是G11778A、T14484C和G3460A;
[0053]所述引物G11778A的sense为：
[0054] 5'-TCAATCAGCCACATAGC-3',
[00巧]所述引物G11778A的antisense为：
[0056] 5'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3',
[0057]所述T14484C的sense为：
[0058] 5'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3',
[0059]所述T14484C的antisense为：
[0060]日'-CGCCCATAATCATACAAA-3'；
[0061]所述G3460A的sense为：
[0062]5,-CTAATGCTTACCGAACGA-3,，
[0063]所述G3460A的antisense为：
[0064] 5' -TGATGGCTAGGGTGACTT-3'；
[0065] 所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[006引所述目的片段的获取包括：W上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-2化g/μ1，作为检 测阴性对照用；
[0067] 2) 25 μ 1反应体系检测：
[0068] PremixTaqPC民Masl:erMIX 12.5μ1 DNA模板 l-lOng/μΙ PrimerU 终浓度为400ηΜ PrimerL 终浓度为400nM 灭菌蒸傭水 邮化25μ1
[0069] 混合均匀；所有样本混合完后，将ΑΒΙVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0070] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0071] 本发明的另一目的在于提供一种检测LEBER氏致病基因突变的引物，其特征在 于，所述引物序列包括：
[0072]沈Q ID N0:1 5'-TCAATCAGCCACATAGC-3'
[0073]沈Q ID N0:2 5'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3'
[0074]沈Q ID N0:3 5'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3'
[00巧]SEQID N0:4 5，-CGCCCATAATCATACAAA-3'
[0076]沈Q ID N0:5 5'-CTAATGCTTACCGAACGA-3'
[0077]沈Q ID N0:6 5'-TGATGGCTAGGGTGACTT-3'。
[0078] 本发明的还一目的在于提供一种包括所述引物的检测LE邸R氏致病基因突变的 试剂盒。
[0079] 本发明的有益效果为：
[0080] 利用3对特异性引物同时对患者的可能的突变位点进行检测，使用该方法能保证 95%W上的疾病检出率。直接W全血样作PCR的DNA模板，设计并合成特异性PCR引物，扩 增产物并进行测序，可W直接检测L册N患者线粒体DNA3个原发性致病突变位点位点的具 体情况，具有较高的特异性和准确性。其解决了现有技术中进行LEBER氏致病基因突变检 测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非 创伤性如血清或血浆等检测。
【附图说明】
[0081] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申 请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：[008引图1是本发明实施例1PCR扩增产物电泳结果示意图。
[0083] 图2为本发明G11778A检测结果示意图。
[0084] 图3为本发明T14484C检测结果示意图。
[0085] 图4为本发明G3460A检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0086]W下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，运些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可W根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0087] 实施例1
[0088] 样本处理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0089]DNA提取，取220μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0090] 1)加 220μ1BufferBL，震荡混合，于 70°C解育 10 分钟；
[0091] 2)加220μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0092] 3) 12000巧m离屯、1 分钟；
[009引4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0094] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[0095]6) 12000巧m离屯、2 分钟；
[0096] 7)加入 700μ1wash Buffer,12000巧m离屯、2 分钟；
[0097] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1wash Buffer,12000巧m离屯、2分 钟；
[0098] 9)弃收集管内液体，12000;rpm离屯、2min;
[0099] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[0100]PCR扩增
[0101]PCR反应体系：
[010引10XPCR Buffer2μ1;
[0103] HotStarTaq DNAPolymerase按kit标准调整；
[0104]dNTPmix2μ1；
[0105]上游引物PrimerU1μ1;
[0106]下游引