西瓜InDel分子标记及其开发方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子标记技术，具体设及西瓜InDel分子标记及其开发方法与应用。
【背景技术】
[0002] 西瓜为葫芦科作物，是世界上热带和亚热带的一种重要经济蔬菜作物。西瓜含有 许多的营养物质，包括巧、铁、钟和维生素（VA和VC)。由于西瓜味甜多汁深受消费者的喜 爱。2013年全球西瓜种植面积为349万公顷，产量达到了 1.09亿吨。
[0003] 分子标记已广泛应用于蔬菜作物的研究，如品种鉴定、遗传多样性分析、进化分 析、连锁图谱构建、比较基因组学、数量性状位点构图、分子辅助育种选择等。有许多的分子 标记被开发用于基础和应用研究，如限制性片段长度多态性（RFLP)、扩增片段长度多态性 (AFL巧和随机扩增多态性（RAPD)。RFLP需要放射性化学物质的参与，RATO重复性较差，运 些缺点限制了标记在育种计划中的应用。与运些早期的分子标记相比，基于PCR的简单重 复序列（SSR)标记相对比较简单、便宜、重复性较好，但是有些扩增条带不清楚及技术上的 缺陷，如假等位基因、无效等位基因导致SSR在基因型分型和数据分析上产生错误。
[0004] 近年来，基因组测序技术的快速发展，尤其Illumina公司的第二代边合成边测序 技术的出现，使得动植物在基因组测序、重测序、转录组分析、sRNA和表观基因组研究等方 面有了很大的进展。高通量测序技术为SSR、SNP和InDel标记的开发提供了可能。SNP是 一种高通量、低成本的新型分子标记，为分子辅助育种提供了一种可选择的方法，但是它受 限于基因型分型技术，虽然有许多的基因型分型技术可获得，但是运些技术在小型和中型 检测中成本高，操作复杂，且需要特殊的设备。 阳0化]InDel标记是指由核巧酸水平上碱基的插入或缺失多态性，在植物基因组中有较 高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强等优点。较之SSR标记，InDel分布密 度远高于SSRs。较之SNP标记，InDel呈现共显性，PCR极易检测，使用成本极低。目前，随 着基因组学及生物信息学的的发展，大量公共数据如表达序列标签巧ST)、cDNA和基因组 序列等信息大量出现，使得通过生物信息学方法可得到候选InDel成为可能。目前已在水 稻、玉米、黄瓜、白菜等主要作物中得到广泛应用。基于高通量测序数据技术开发WPCR为 基础、操作简单、应用价值大的InDel标记，可为控制西瓜重要农艺性状基因的定位、遗传 多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与高密度遗传连锁图谱的构建和分子标记 辅助选择育种奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于开发西瓜InDel分子标记，提供多态性引物，建 立西瓜InDel标记开发的技术体系，为西瓜的遗传背景分析提供更多新的InDel标记，弥补 目前西瓜InDel标记较为缺乏的不足。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一组西瓜InDel分子标记，其特征 在于：所述InDel分子标记包括有如下54个位点所对应的正向和反向引物：
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[0010]本发明所述的西瓜InDel分子标记的开发方法，包括W下步骤： 阳0川 1)对西瓜抗病自交系JRwOS-3的基因组DNA进行提取； 阳〇1引。构建DNA文库，利用Illumina Hiseq2500平台进行阳150模式重测序；利用生 物信息学软件对序列进行清理、组装成Contigs ;通过大规模同源比对进行InDel位点的筛 选；利用R语言结合Primer3. 0引物设计软件，大规模设计InDel标记引物；
[0013] 3)利用InDel引物对西瓜基因组DNA进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及非变性聚 丙締酷胺凝胶电泳检测。
[0014] 进一步的，在所述步骤3)中PCR扩增反应体系为20ul，其中含2μ1基因组 DNA(200ng/yl)，2yl10XPCRbuffer(2.OmMMgCl2)，2. 0μ1dNTPs(2. 5πιΜ)，1.0μ1正向 引物（10μΜ)，1.0μ1反向引物（10μΜ)，0. 5μ1 2. 5Units/ylTaqDNA聚合酶灯AKARA)， 11. 5μ1 (1地2〇。 阳01引进一步的，在所述步骤3)中PCR扩增程序为94°C5min;94°C40S，55°C30S， 72°C45S，36 个循环；72°ClOmin。
[0016] 进一步的，在所述步骤3)中琼脂糖凝胶电泳电压条件为120V恒压，电泳时间为 0.化~比；非变性聚丙締酷胺凝胶电压条件为预电泳50V~60V30min，120V电泳化~ 2.2h〇
[0017] 进一步的，该方法可应用于包括黄瓜、冬瓜、南瓜、丝瓜在内的所有葫芦科作物 InDel分子标记的开发。
[0018] 本发明所述的西瓜InDel分子标记在西瓜遗传图谱构建、Q化定位、分子辅助育种 及遗传多样性分析中的应用。
[0019] 本发明利用Illumina重测序技术对西瓜抗性父本材料的基因组进行了测序。在 15461个contigs鉴定得到了 25701个潜在的InDel标记，合成了 69对引物，通过PCR扩增 筛选发现了 54对多态性引物。通过发掘西瓜Illumina测序数据，开发了新型多态性InDel 标记，对西瓜的抗性育种具有重要意义。
【附图说明】
[0020] 图1为54个InDel标记琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
[0021] 1 ~54 分别为InDelOl、InDel03、InDel04、InDel07、InDelOS、InDelOg、InDellO、 InDelll、InDell3、InDell4、InDell7、InDellS、InDelig、InDel20、InDel21、InDel22、 InDel23、InDel24、InDel26、InDel28、InDel29、InDel30、InDel31、InDel32、InDel33、 InDel34、InDel35、InDel36、InDel37、InDel38、InDel39、InDel40、InDel41、InDel42、 InDel43、InDel44、InDel45、InDel46、InDel47、InDelSO、InDelSl、InDel52、InDel53、 InDel54、InDel55、InDel57、InDel58、InDel60、InDel63、InDel64、InDel65、InDel67、 InDel68、InDel69,前一泳道为母本JSwOl-1，后一泳道为父本JRw08-3,M为用于纠正实验 偏差的标准分子量。
【具体实施方式】
[0022] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0023]所用DNAMaker为TaKaRa公司生产的DL2000,由DNA片段 2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、lOObp组成，共6条带。
[0024] 1、西瓜DNA的提取
[00巧]参考Liu,L.W. ,W.Z.加0,X.F.Zhu,andT.Z.Zhang.Inheritanceandfine mappingoffertilityrestorationforcytoplasmicmalesterilityinGossypium