检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药技术领域，具体地说是多位点基因检测忍片，尤其是适用于 中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的快速诊断的集成检测方法。
【背景技术】
[0002] 中枢神经系统（centralnervoussystem,CN巧感染是神经系统主要疾病谱之一， 临床多表现为脑膜（脑）炎症状，如发热、头痛、呕吐、意识障碍及脑膜刺激征等，病死率和 致残率高，早期明确的病原学诊断是临床正确抗感染治疗的关键。真菌性病原体是引起CNS 感染的众多病原微生物中较常见之一。长期W来，临床微生物实验室用于诊断真菌性CNS 感染病原体的方法主要包括脑脊液涂片镜检与培养鉴定等表型方法、脑脊液免疫学检测方 法及基于聚合酶链反应（PCR)的各种技术（如RT-PCR，多重PCR，巧光定量PCR等），鲜有利 用真菌18/28SrRNA基因结构特点构建基因忍片来鉴定病原体的报道。
[0003] 脑脊液涂片镜检和培养等表型方法目前仍是各临床实验室诊断中枢神经系统感 染最常用的检测手段，从中发现致病菌是判断感染的"金标准"，但运些常规方法存在如下 不足：（1)由于实验室检测方法学原因导致感染病原体无法检测或检测周期过长，滞后于 临床需求使确诊困难而错失早期或关键期的治疗机遇：①脑脊液涂片显微镜检查，检出率 低，敏感性差；②脑脊液真菌培养所需时间长（4-7天）、培养阳性率低（约10-15%左右）； ③受抗生素使用等因素影响、无法实现广谱病原体的筛查和监测。（2)由于病原体无法或快 速准确的分离鉴定，导致治疗的盲目性，使耐药菌增加并加重患者负担：①目前使用的全自 动真菌鉴定仪在鉴定某些菌时可能出现差错，鉴定准确性值得商権；②商品化表型鉴定系 统数据库有限，很难区分表型相近病原菌；③质谱鉴定仪鉴定目前仍需先获得阳性菌落，直 接检测鉴定真菌病原体仍需大量样本来验证。
[0004] 脑脊液免疫学检测方法（如隐球菌乳胶凝集检测）只能检测特定病原体，不能检 测脑脊液中未知真菌和对病原菌进行分类，存在假阳性率高等缺点。PCR检测方法主要采用 巧光定量PCR技术和脱氧核糖核酸测序技术，目前运些技术只能针对单个真菌核酸进行检 巧。，通量低；脱氧核糖核酸测序技术操作复杂，不便于在检验科实验室常规开展，其结果的 判定亦存在一定错误的风险，需多拷贝双向测序。而目前众多基因忍片多W硝酸纤维膜和 尼龙膜等不同载体和地高辛、胶体金显色等方法制备，虽有基于真菌leSrRNA微型寡合巧 酸忍片检测脑脊液病原菌的研究，但存在致病菌覆盖不全面、缺少大样本临床验证数据等 不足，鲜有真菌病原体诊断性忍片的报道。
[0005] 目前临床微生物实验室采用的传统培养鉴定存在诸多客观缺点，如依靠表型鉴 定、敏感性低、检测周期长、易受抗生素应用等各方面的限制，鉴定准确性亦值得商権，不能 满足临床快速诊断的要求。目前进行菌种分型的方法主要有聚合酶链式反应-限制性片段 长度多态性（PCR-RFLP)、测序、序列特异性引物PCR、巧光定量PCR等方法，不仅操作繁琐、 检测周期长、通量小，且检测过程影响因素多、不易控制，不能同时对多种病原体进行分型， 难w满足临床检验的要求，使临床至今无法开展中枢神经感染真菌病原体的广谱、集成检 测。
[0006] 基因忍片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，其 主要原理是将能反映样本中大量基因信息的基因探针（寡核巧酸探针、cDNA克隆、PCR产物 等）W-定顺序和密度固定在载体（如载玻片或娃片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、塑料片等） 上形成阵列，与实际样本（或核酸扩增产物）进行杂交反应，通过杂交信号分析可高通量获 得所有待检基因的信息。该技术W其高通量、快速、准确性高等优点为感染病原学诊断提供 了一条新的解决途径，对患者感染性疾病的临床治疗、预后评估具有重要作用。
[0007] 真菌核糖体RNA(rRNA)包括5S、5. 8S、18S、28SrRNA，W多拷贝形式存在于所有真 核染色体基因中。国内外有利用真菌内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer, 口巧 基因结构特点用于真菌鉴定的报道。但未见有基于真菌rRNA的忍片技术用于临床检测脑 脊液真菌的研究。目前市场上最主要的基因忍片产品是W点样等方法制备的用于基因表达 检测的中、低密度基因忍片。基因忍片的一个重要发展趋势是忍片制备、样品处理、杂交、检 测W及数据分析的标准化，提高基因忍片的准确性和可靠性。因此，如何即保证检测高通 量，又保证忍片性能优越性是其的瓶颈问题之一。而利用基于真菌28SrRNA基因的多位点 忍片检测多种中枢神经感染真菌病原体，发挥其操作简单、通量大、结果准确等特点，对于 临床分析中枢神经感染真菌病原体及种类具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊 液中病原菌的基因忍片及试剂盒，利用基于真菌28SrRNA基因的多位点忍片检测多种中枢 神经感染真菌病原体的问题。
[0009] 本发明的一个目的是提供一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌 的基因忍片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核巧酸探针，其特征在于：所述寡 核巧酸探针包括在基质上设置的真菌28SrRNA通用探针和鉴定真菌的种特异性探针，所 述鉴定真菌的种特异性探针为SEQIDN0:l-N0:4所示的碱基序列的DNA片段，所述真菌 28SrRNA通用探针为SEQID^:5所示的碱基序列的0臟片段。
[0010] 进一步地，上述鉴定真菌的种特异性探针5'端含有氨基修饰的聚dT串，所述氨基 修饰的聚dT串为16聚的聚脱氧胸巧酸。
[0011] 进一步地，该基因忍片还包括SEQIDNO:6所示的标记有生物素点的DNA序列。
[0012] 进一步地，所述固相载体为修饰玻片或娃片。
[0013] 本发明的另一目的还在于提供一种用于检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液 中病原菌的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述基因忍片。
[0014] 进一步地，所述试剂盒还包括SEQIDNO:7-N0 :8所示的引物序列。
[0015] 进一步地，所述引物的5'端带有标记基团，所述标记基团包括：地高辛分子、生物 素分子、巧光素及其衍生物分子、切3,切5、碱性憐酸酶、辣根过氧化物酶。
[0016] 本发明还提供了一种检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的方法，不 用于疾病的诊断和治疗，其特征在于：包括如下步骤：
[0017] (1)用常规方法制备模板DNA;
[001引 似用权利要求6所述引物序列将步骤（1)中制备的模板DM通过PCR反应进行 扩增，获得5'端带有标记基团DNA扩增产物；
[0019] (3)将步骤（2)中DNA扩增产物与杂交缓冲液混合；
[0020] (4)将步骤（3)中所得混合液与权利要求3所述的基因忍片上面分布的DNA探针、 Bio进行杂交反应；
[0021] (5)完成步骤（4)杂交反应后，检测基因忍片的杂交信号，根据标记信号在基因忍 片上的位置、强度等信息获取待测信息。
[0022] 进一步地，在所述步骤（4)前先将基因忍片与预杂交缓冲液进行预杂交。
[002引进一步地，所述步骤似中PCR反应的步骤，还包括：
[0024] 1)94°C预变性 5 分钟；2)94°C变性 45s;3)58°C退火 45s;4)72°C延伸 60s，重复 2)-4) 30次；5)最后72°C延伸7min的反应步骤。
[00巧]本发明适用于从脑脊液等临床标本中直接提取病原菌DNA用于PCR扩增，祀基因 用于杂交检测，可用于疑似真菌性感染的病原体筛查。本发明W固体材料载体为基质，便于 生产和操作；用真菌通用引物PCR方法扩增祀基因，避免了费时的培养阶段，大大缩短了检 测时间（约4小时左右）；利用标记的祀序列和基质上的寡核巧酸探针进行杂交的鉴定方 法较基于生理和生化的鉴定方法更准确，增加了检测准确度，且不受培养条件和真菌生理 状态的影响；无论菌"死活"，基因忍片检测结果均提供重要临床价值。该技术方法不仅能在 较短的时间明确真菌的存在与否，还可判读临床常见感染性疾病病原菌，