可分泌抗ev71病毒蛋白vp1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗 体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] 手足口病（Hind-f 〇〇 t-mouth di sease，HFMD)是一种主要由肠道病毒71型 (Enterovirus71，EV71)或柯萨奇病毒 16型(Coxsackievirus A16，Cox A16)感染导致的流 行性疾病，两种病毒常相伴造成手足口病的暴发流行，每次流行中两种病毒所占比例有所 不同。感染后临床表现多样，从隐形感染、普通手足口病到中枢神经系统感染等重症，部分 重症患者病情进展较快，甚至死亡。患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下儿童发病率高。与 其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病发生重症感染的比例相对较 高。肠道病毒EV71的临床诊断主要依据三个方面:一是临床表现，而是血清学证据，三是病 原学证据。由于肠道病毒EV71型感染临床表现多，因此肠道病毒EV71的血清学检测和病原 学检测时目前最主要的依据。EV71感染后可在咽部会分泌物、粪便和皮疹的疱液中排出病 毒。病原学检测方法中，病毒分离是最早用于EV71病毒的检测诊断的方法，这种方法具有较 高的特异性，但由于计数操作难度大、周期长、不适合临床使用。RT-PCR技术用于检测病毒 RNA，具有快速、简便的优点，而且还有很高的灵敏度和特异性。但其灵敏度一方面依赖于患 者携带的病毒与所用引物的匹配性，另一方面也受到扩增片段的高级结构的很大影响。另 外，RT-PCR本身对于操作环境及操作人员的要求较高，并且价格昂贵，因此难以在广大基层 单位中使用。结合以上方面，血清学检测显得较为简便，节约时间，且易操作。
[0003] 肠道病毒71型(EV71)基因组含有大约7.5kb的单链正股RNA，包括5'端非编码区、 3'端非编码区和由P1，P2，P3所组成的多蛋白。共编码11种蛋白，其中4个结构蛋白VP1、 ￥?2、￥卩3、￥卩4,7个非结构蛋白2厶、28、2(：、3厶、38、3(：、30。其中￥?1、￥?2、￥?3暴露于病毒外壳的 表面，为EV71主要的抗原变异位置;VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部的RNA结合，其功能类 似病毒外壳的锚，用以稳定病毒蛋白的结构。非结构蛋白2A为分裂初期先驱蛋白质，也与终 止宿主细胞合成其本身所需蛋白有关;3C蛋白则参与大部分的蛋白裂解反应;3D为RNA聚合 酶，在病毒RNA复制时主导转录及复制反应；2B、2C、3A、3B等四种蛋白则与病毒RNA复制有 关。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VP1是EV71病毒的主要中和决定因子，因此VP1蛋白 可被认为是最适合来建立检测方法的抗原。
[0004] 在血清中和试验中，EV71和Cox A16-般难以区分，病毒变异、样本中存在多个交 叉同源性的病毒等因素均可能影响抗原分型。传统的HRP标记多克隆兔抗血清抗体建立的 双抗体夹心法也无法准确的检测EV71病毒。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要提供一种与其他病毒无交叉、可以准确的检测EV71病毒检测试剂 盒，以及可应用在该EV71病毒检测试剂盒中的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂 交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
[0006] -种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No: C2015225〇
[0007] 上述的杂交瘤细胞在制备EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备中的应用。
[0008]在一个实施例中，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-7。
[0009] -种可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No: C2015226〇
[0010] 上述的抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体在制备EV71病毒检测试剂或检测设备中的 应用。
[0011]在一个实施例中，所述抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体记为7P1-11。
[0012] 一种EV71病毒检测试纸，其特征在于，包括上述的7P1-7和上述的7P1-11。
[0013] 在一个实施例中，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线 及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一 端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫 与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及 所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质 控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有7P1-7包附胶体金颗粒形成的胶体 金标记的单克隆抗体，所述检测线为7P1-11，所述质控线为羊抗鼠 IgG抗体。
[0014] 一种EV71病毒检测试剂盒，包括上述的EV71病毒检测试纸。
[0015] 上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体具 有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在制备EV71病毒导致的手足口病诊断的检测领 域，如检测试剂或检测设备的制备领域等。
[0016] 上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗EV71病毒蛋白VP1的单克隆抗体具 有高敏感性、高特异性等优点，可广泛应用在制备手足口病早期分型诊断的检测领域，如检 测试剂或检测设备的制备领域等，可以实现准确、快速地检测出EV71病毒，而与柯萨奇病毒 (Cox A16)、普通肠道病毒无交叉，有利于对EV71病毒作出早期分型诊断，且在特异性、灵敏 度等方面较之传统的检测方法具有显著的优势，可以应用于EV71病毒早期检测。
【附图说明】
[0017] 图1为一实施方式的EV71病毒检测试纸的正面示意图；
[0018]图2为图1中EV71病毒检测试纸的纵截面示意图；
[0019]图3为一实施方式的EV71病毒检测试剂盒的示意图。
【具体实施方式】
[0020] 下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交 瘤细胞、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。
[0021] 一实施方式的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞于2015年12 月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC No:C2015225，分类命名：杂交瘤细胞株7P1-7。该杂交瘤细胞可分泌出抗EV71病毒蛋 白VP1单克隆抗体的单克隆抗体，记为7Ρ1-7,7Ρ1-7可以作为检测抗体。7P1-7可以应用于 EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备的制备领域中。
[0022]另一实施方式的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞于2015年12 月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC No: C2015226，分类命名：杂交瘤细胞株7P1-11。该杂交瘤细胞也可分泌出抗EV71病 毒蛋白VP1单克隆抗体的单克隆抗体，记为7P1-11，7P1-11可以作为捕获抗体。7P1-11可以 应用于EV71病毒检测试剂或EV71病毒检测设备的制备领域中。
[0023] -实施方式的EV71病毒检测试剂盒包括壳体、EV71病毒检测试纸和其他检测试 剂。
[0024] 如图1和图2所示，本实施方式的EV71病毒检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫 120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫 130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片 110上。样品垫120与金标垫130部分重叠，金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠，硝酸纤 维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜140上，且检测 线160设在靠近金标垫130的一端，质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用 不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。金标垫130上涂覆有7P1-7包附胶体金颗粒形 成的胶体金标记的7P1-7。检测线160为7P1-11。质控线170为羊抗鼠 IgG抗体。
[0025]本实施方式中，7P1-7作为检测抗体，7P1-11为捕获抗体。在其他的实施方式中，也 可以选择7P1-11作为检测抗体，7P1-7为捕获抗体。
[0026] 如图3所示，EV71病毒检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开 设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线170裸 露于观察窗220中，方便观察。
[0027]其他检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。
[0028]上述EV71病毒检测试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中的是否含有VP1蛋 白。检测时，VP1蛋白先和胶体金标记的7P1-7结合形成VP1-胶体金标记的7P1-7复合物，由 于毛细管作用，VP1-胶体金标记的7P1-7复合物沿硝酸纤维素膜140向前泳动，到达检测线 160时，VP1-胶体金标记的7P1-7复合物会与7P1-11结合，形成7P1-11-VP1-胶体金标记的 7P1-11的复合物，从而富集在检测线160上，形成红色沉淀线。未结合VP1蛋白的胶体金标记 的7P1-11则通过检测线160,被羊抗鼠 IgG抗体捕获，富集在质控线170上，形成红色沉淀线。 当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。