一种用于nk细胞体外扩增的培养基及nk细胞体外扩增的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体 外扩增的方法。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，在抗肿瘤和抗 病毒感染免疫中起着重要作用。由于NK细胞杀伤活性无 MHC限值，因此称为自然杀伤细胞。 NK细胞的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞（如血细胞)及寄生虫 等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染免疫的重要组成部分。由于这些特点，NK细胞在细胞 免疫治疗上有着广泛的应用前景。在体外被活化的NK细胞毒性较高，可用作免疫细胞的治 疗制剂。人体体外及动物试验证实了其对各种癌症治疗的可能性:利用肿瘤细胞系的方法， 确认其对血液系统肿瘤（白血病和淋巴瘤等）、肝癌、肺癌、肾癌、神经系统肿瘤和皮肤癌等 均具有体外细胞毒性，特别是对白血病和神经源性肿瘤已明确了其临床及非临床的治疗效 果。2009年，NK细胞治疗技术就已列入国家三类医疗技术目录。
[0003] 充足的细胞数量和强烈的细胞毒性是细胞治疗疗效提升的关键因素。由于人外周 血中NK细胞含量很少(约占淋巴细胞的5~10%)，从外周血中分离NK细胞成本昂贵，而且分 离的NK细胞一般都处于非活化状态，在很大程度上限制了其在临床上应用。要达到治疗效 果，所需的有效NK细胞数量单一批次应用至少要5 X109个(且纯度达到80%以上），目前有 报道的采用无血清培养体系，通过IL-2、IL-21及相关组合因子刺激培养均不能实现NK细胞 的高活性、高纯度和高扩增倍数，其扩增能力最多达到300倍，临床应用存在安全风险。通过 自体血清培养体系实现规模扩增，且获得单一培养体系、单批次扩增的细胞数量大于IX 101()个疆细胞，且纯度大于90%的未见报道。
[0004] CN 102586185 A公开了一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，具体为使用跨膜 IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活 自然杀伤细胞的方法，该发明是以K562细胞系转录稳定表达⑶8α-白介素21、CD14、⑶19、 ⑶86和⑶137的表达载体，⑶8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，⑶8α基因连接白介素21基因后 使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；然后培养Κ562细胞一段时间，最后经物理、 化学方式得到纯化的Κ562细胞，再对ΝΚ细胞进行培养。CN 102268405 Β公开了一种自体ΝΚ 细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基。该方法是利用如下成套培养基并同时添加 饲养细胞体外活化扩增自体ΝΚ细胞：由培养基1、培养基2和培养基3组成的成套培养基;所 述培养基1是在干细胞生长培养基中添加人白细胞介素2、人白细胞介素12、人白细胞介素 15、人白细胞介素18、植物血凝素、抗人Τ细胞CD3单克隆抗体和离体的人血浆得到的液体培 养基;所述培养基2与所述培养基1相比，所述培养基2中无所述植物血凝素和所述抗人Τ细 胞CD3单克隆抗体，其它成分均与所述培养基1的相同；所述培养基3与所述培养基2相比，所 述培养基3将所述培养基2中的所述离体的人血浆替换为离体的人ΑΒ血清，其它成分均与所 述培养基2的相同。CN 103849599 Α公开了一种高效扩增自体ΝΚ细胞的培养基及培养方法。 所述培养基内含有白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细 胞介素12(IL_12)、肿瘤坏死因子a(TNFa)和抗CD3抗体，可以高效扩增和活化NK细胞，从而 获得大量高活性的以NK细胞为主的免疫细胞回输人体，在抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节 相关疾病的治疗中具有显著疗效。根据本发明的高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方 法，其由细胞培养用培养基和添加于所述细胞培养用培养基的添加因子构成，用于大量培 养扩增自体活化的NK细胞，其特征在于，所述添加因子包含有白细胞介素2(IL-2)、白细胞 介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子a(TNFa)和抗 CD3抗体。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种杀伤能力大于90%的新型的用于NK细胞体外扩 增的培养基及NK细胞体外扩增的方法；
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种培养规模达到20L且可平行放大用于规模化生产 的用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法；
[0007] 本发明的目的之三在于提供一种能实现NK细胞短时间内爆发性增殖的用于NK细 胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法。
[0008] 第一方面，本发明提供一种用于NK细胞体外扩增的培养基，按体积百分含量包括 如下组分:淋巴细胞无血清培养基100 %或RPMI1640培养基1~90 %和淋巴细胞无血清培养 基10~99%的混合物，以及血清替代物和白介素2;其中，所述血清替代物的浓度为0.5~ 4g/L，例如可以是 0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、lg/L、1.2g/L、1.5g/L、2g/L、 2.2g/L、2.5g/L、3g/L、3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L、3.9g/L 或 4g/L，所述白介素 2的浓度为 50~ 500yg/mL，例如可以是 50yg/mL、5 lyg/mL、52yg/mL、53yg/mL、55yg/mL、56yg/mL、58yg/mL、60 yg/mL、65yg/mL、70yg/mL、75yg/mL、80yg/mL、85yg/mL、90yg/mL、95yg/mL、100yg/mL、110yg/ mL、120yg/mL、130yg/mL、140yg/mL、150yg/mL、160yg/mL、170yg/mL、180yg/mL、200yg/mL、 220yg/mL、240yg/mL、250yg/mL、280yg/mL、300yg/mL、320yg/mL、350yg/mL、380yg/mL、400μ g/mL、420yg/mL、450yg/mL、480yg/mL或 500yg/mL。
[0009] 本发明中，白介素2的作用是刺激淋巴细胞的生长，血清替代物、淋巴细胞无血清 培养基以及RPMI1640培养基的作用均为供给和补充细胞营养物质。
[0010] 优选地，所述培养基按体积百分含量包括如下组分:淋巴细胞无血清培养基:4〇~ 50%和RPMI1640培养基:50~60%，以及血清替代物和白介素2。
[0011]优选地，所述血清替代物的浓度为1~3g/L。
[0012] 优选地，所述白介素2的浓度为200~300yg/mL。
[0013] 第二方面，本发明提供如第一方面所述的培养基进行NK细胞体外扩增的方法，包 括制备跨膜结合蛋白为白介素15或白介素21的K562细胞的步骤，所述K562细胞包括引导 肽、跨膜结合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引导肽为非病毒引导肽;所述分子膜定 位蛋白为004;所述膜蛋白为001371^、0086、0019和0064的混合物;所述跨膜结合蛋白与膜蛋 白的相应序列通过2A序列串联。
[0014] 本发明K562细胞的跨膜结合蛋白与膜蛋白的序列连接方式采用2A方式串联，而现 有技术均采用病毒相连，使得本发明在临床细胞制备和应用上更安全。其中，CD137L能与T 细胞的CD137特异性结合，刺激分泌IFN-，从而刺激淋巴细胞的增殖;CD19能提升NK细胞活 性，激活NK细胞靶向功能;CD64和CD86起到诱导NK细胞增殖的作用。
[0015] 在本发明中，制备所述K562细胞的具体步骤如下：
[0016] (1)人工合成GM-CSF序列、IL-21/15序列、CD4序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序 列和CD64序列，并将IL-21/15序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序列和CD64序列通过2A序 列串联，插入到带有抗生素标记的真核表达载体中；
[0017] (2)将步骤（1)得到的真核表达载体测序，正确后进行纯化，再与带有转座酶的质 粒共转染到K562细胞中，加入抗生素进行加药处理，获得阳性转染细胞；
[0018] (3)将步骤（2)得到的阳性转染细胞再加入抗生素进行加药处理，流式细胞仪分 选，获得高纯度转染K562细胞；
[0019] (4)再经过加药处理和5~20次的流式细胞仪分选，获得100%阳性转染的K562细 胞，阳性细胞经稳定传代20代以上，获得基因组整合外源基因的稳定转染细胞系；
[0020] (5)将步骤(4)获得的稳定转染细胞系再进行流式细胞仪分选，获得基因组整合外 源基因高表达的稳定转染细胞系。
[0021] 作为优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
[0022] (1)制备所述跨膜结合蛋白为白介素15的K562细胞；
[0023] (2)将所述NK细胞培养基、CD16单克隆抗体与外周血单个核细胞共培养；
[0024]任选地，步骤(2'）：将所述NK细胞培养基、⑶16单克隆抗体、步骤（1)所述跨膜结合 蛋白为白介素15的K562细胞与外周血单个核细胞共培养；
[0025] (3)在培养的后续过程中，添加所述NK细