一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物及分子生物学领域，尤其涉及一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及利用该方法制成的真菌检测试剂盒。本发明方法包括微量真菌细胞的获取、真菌细胞壁破壁提取真菌原生质、微量真菌原生质gDNA的提取和扩增、微量gDNA建库、基因组测序、生物信息学分析比对、判定所检测真菌的种类等步骤。本发明方法实现了对微量真菌的高效检测，可以直接应用于微量、疑难真菌样本或混合样本的分离、检测、鉴别及遗传信息的深入研究。本发明真菌检测方法及试剂盒适用于工业生产、环境监测、空气检测、土壤检测、水质检测、食品检测、药品检测、化妆品检测、保健品检测以及医学检测等领域。
【专利说明】
-种利用单细胞测序检测微量真菌的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及微生物及分子生物学领域，尤其设及一种利用单细胞测序检测微量真 菌的方法及利用该方法制成的真菌检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 1.现有单细胞测序技术概述
[0003] 1)目前单细胞测序技术主要用于人或哺乳动物胚胎细胞、干细胞发育研究，此类 细胞只有细胞膜，没有细胞壁，因而无需破壁，从微量细胞中提取曲NA比较容易。
[0004] 2)有报道单细胞测序技术用于植物种子发育、植物内生真菌的细胞测序研究，此 类细胞可W被分离培养，所W比较容易获得纯细胞系进行分子检测实验。
[0005] 2.现有的真菌破壁、DNA提取技术概述
[0006] 1)物理方法:于研鉢中加液氮研磨、研磨仪低溫研磨，但此法需要大量的菌体，不 能应用于微量样本。
[0007] 2)化学方法:氯化节提取法等，易降解，所提取的DNA完整性差，一般只够做PCR，难 W达到用于基因组建文库的完整性要求。
[000引3)酶法:蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶、溶壁酶等，效率低，所提取的DNA不够微量样本 进行建库的量。
[0009] 3.现有对微量真菌样本的检测技术概述
[0010] 1)镜检:直接在显微镜下观察，虽然简便、快速，但灵敏度低，需要丰富经验，极易 漏检。
[0011] 2)培养:培养过程中真菌的形态和生化指标可作为检测的重要标准，但耗时长、易 污染、很多真菌(尤其是病原真菌)难W在人工培养条件下培养成功。
[0012] 3)PCR及基因忍片技术:适用于有明确范围的真菌检测，需要有针对性的设计引 物、探针，不适用于完全未知的物种。
[0013] 4)使用通用引物进行PCR扩增后进行一代测序:适用于单一的未知真菌检测，一般 用于可培养的纯菌检测，不适用于复杂样本的一次性检测。
[0014] 5)应用新一代宏基因组测序:可用于复杂样本的检测，但由于真菌的DNA与其他微 生物或哺乳动物相比难W提取，所W会产生大量与目的菌种无关的数据，数据的甄别难度 很大。
[0015] 根据W上对现有技术的概述可W看出，目前针对微量真菌的检测技术主要存在W 下技术缺点：
[0016] 1.难W对微量、不可培养或培养难度大的真菌进行高效破壁。
[0017] 2.难W对微量真菌提取足量的可进行基因组建库的曲NA。
[0018] 3.难W对复杂样本中特定的真菌进行检测。
[0019] 总而言之，真菌破壁提取完整基因组DNA-直是本领域中的难题，尤其是微量真菌 样本，如何在微量的复杂样本中，提取可W达到二代测序建文库所需的真菌曲NA,并对其进 行全基因组测序是目前还未有人报道的。
[0020] 本发明方法通过取真菌微量细胞进行破壁，提取、扩增曲NA,并进行新一代测序的 文库建立、基因组测序分析等步骤，可W很好的克服上述技术缺陷，从而实现对微量真菌的 高效检测，本发明方法可W直接应用于微量、疑难真菌样本或混合样本的分离、检测、鉴别 及遗传信息的深入研究。根据本发明方法制成的真菌检测试剂盒可广泛应用于工业生产、 环境监测、空气检测、±壤检测、水质检测、食品检测、药品检测、化妆品检测、保健品检测W 及医学检测等多种领域。本发明技术的推广应用将会具有良好的市场前景并产生可观的经 济及社会效益。
【发明内容】
[0021] 解决的技术问题
[0022] 本发明需要解决的问题是:本发明的目的是克服现有微量真菌检测技术所存在的 不足，如难W对微量、不可培养或培养难度大的真菌进行高效破壁;难W对微量真菌提取足 量的可进行基因组建库的曲NA;难W对复杂样本中特定的真菌进行检测等问题。
[00剖技术方案
[0024] 本发明旨在建立一套完整的微量真菌检测技术方案，W解决目前存在的难W分离 培养、难W用常规方法对复杂样本中的微量真菌进行分子检测和遗传信息研究的技术难 题。
[0025] 本发明方法通过复杂样本中单个真菌细胞的分离获取和对其原生质的提取，尤其 是对该真菌细胞壁的高效破除，W及对上述真菌原生质进行曲NA提取、扩增和建库，并与新 一代测序技术结合分析基因组信息，而不是传统的PCR或基因忍片层次的单个或多个特定 序列的测定和分析，最终实现对该真菌的准确检测。
[0026] 首先，本发明提供了一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法，包括W下步骤：
[0027] (1)微量真菌细胞的获取:将微量真菌样本涂于激光显微切割覆膜载玻片上，用激 光显微切割系统找到目的细胞，用激光强度37-43微焦对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，获得单个目的细胞，重复上述操作获取总数为1-100个的目的细胞；
[0028] (2)真菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质；
[0029] 1)将0.8M D-山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离屯、管中，在4°C条件下浸泡 目的细胞2小时；
[0030] 2)配制复合预处理剂:将50mM Tris，5mM邸TA，5%0-琉基乙醇混合均匀；
[0031] 3)配制混合酶处理剂:将蜗牛酶1-lOmg/mL，溶壁酶1-lOmg/mL，溶菌酶I-IOmg/血， 纤维素酶1-lOmg/mL四种酶中的至少两种酶按一定比例混合，当所述混合酶处理剂仅由两 种酶混合组成时，其中至少包括蜗牛酶和溶壁酶中的一种；
[00创 4)将上述复合预处理剂加入装有目的细胞的离屯、管中，35°C处理细胞1小时；
[0033] 5)上述离屯、管经离屯、后将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0034] 6)向上述离屯、管中加入无菌水洗涂细胞两次，离屯、，弃去液体；
[0035] 7)向上述离屯、管中加入混合酶处理剂，35-45。(：处理3-12小时；
[0036] 8)上述离屯、管经离屯、后将细胞收集至管底，弃去液体；
[0037] 9)向上述离屯、管中加入PBS洗涂细胞一次，离屯、，弃去液体，保留4-lOiil细胞悬液；
[0038] (3)微量真菌原生质曲NA的提取和扩增：利用单细胞全基因组扩增试剂盒对上述 步骤中获得的4-lOiil细胞悬液进行核酸提取及扩增反应，获得上述真菌曲NA;
[0039] (4)微量曲NA建库:利用DNA建库试剂盒对上述真菌曲NA进行建库；
[0040] (5)基因组测序:对上述建库的真菌曲NA进行全基因组测序；
[0041] (6)生物信息学分析:利用相关软件对测序获得的数据进行组装，得到组装结果与 相关公开数据库进行比对，判定所检测真菌的种类。
[0042] 进一步地，本发明方法可检测的真菌包括念珠菌属中的白色念珠菌、光滑念珠菌、 克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌；曲霉属中的烟曲霉、黄曲霉、±曲 霉、构巢曲霉、黑曲霉、焦曲霉;隐球菌属中的新生隐球菌、格特隐球菌W及上述各菌种的变 种;上述各菌种及其变种均属于临床医学中的致病菌，虽然是可被体外培养的，但由于患者 用药等因素，在真实临床样本中难W被分离培养成功。
[0043] 进一步地，本发明方法可检测的真菌还包括马拉色菌，该菌种属于苛养的真菌，对 培养条件要求苛刻，需要在培养基中补充特殊营养成分才能够培养成功。
[0044] 进一步地，本发明方法可检测的真菌还包括组织胞浆菌、伊蒙菌、申克氏抱子丝 菌、马尔尼菲青霉、己西副球抱子菌、皮炎芽生菌、粗球抱子菌;上述菌种在体外难W培养成 功。
[0045] 作为一种优选方案，本发明方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁:化学法与混合酶 法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶6mg/mL和溶壁酶4mg/mL向离 屯、管中加入混合酶处理剂后，37°C处理6小时;最终保留化1细胞悬液。
[0046] 作为另一种优选方案，本发明方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁:化学法与混合 酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶6mg/mL和溶菌酶4mg/mL;向 离屯、管中加入混合酶处理剂后，45°C处理10小时;最终保留化1细胞悬液。
[0047] 作为另一种优选方案，本发明方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁:化学法与混合 酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶4mg/mL、溶壁酶4mg/mL和溶 菌酶4mg/mL向离屯、管中加入混合酶处理剂后，35°C处理8小时;最终保留化1细胞悬液。
[0048] 作为另一种优选方案，本发明方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁:化学法与混合 酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶4mg/mL、溶壁酶3mg/mL和纤 维素酶3mg/mL向离屯、管中加入混合酶处理剂后，37°C处理3小时;最终保留化1细胞悬液。
[0049] 作为另一种优选方案，本发明方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁:化学法与混合 酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶4mg/mL、溶菌酶3mg/mL和纤 维素酶3mg/mL向离屯、管中加入混合酶处理剂后，37°C处理12小时;最终保留祉1细胞悬液。
[0050] 作为另一种优选方案，本发明方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁:化学法与混合 酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为溶壁酶5mg/mL、溶菌酶4mg/mL和纤 维素酶3mg/mL向离屯、管中加入混合酶处理剂后，37°C处理6小时;最终保留IOiil细胞悬液。
[0051] 作为另一种优选方案，本发明方法中的第(2)步骤真菌细胞壁破壁:化学法与混合 酶法结合提取真菌原生质，其中配制的混合酶处理剂为蜗牛酶4mg/mL、溶壁酶2mg/mL、溶菌 酶3mg/血和纤维素酶4mg/血；向离屯、管中加入混合酶处理剂后，37°C处理6小时；最终保留6 yl细胞悬液。
[0052] 此外，本发明还提供了一种根据本发明微量真菌检测方法制成的真菌检测试剂 盒，该真菌检测试剂盒可适用于W下领域:工业生产、环境监测、空气检测、±壤检测、水质 检巧U、食品检测、药品检测、化妆品检测、保健品检测W及医学检测。
[0化3]有益效果
[0054]本发明的微量真菌检测方法及相应试剂盒克服了现有技术存在的许多不足，为从 复杂样本中分离获取难W培养的真菌提供了方案;为微量真菌的高效破壁提供了优化的技 术方案;并为针对复杂样本中微量真菌进行基因组测序分析提供了整套的技术方案，最终 实现了对微量真菌的高效检测。本发明方法可W直接应用于微量、疑难真菌样本或混合样 本的分离、检测、鉴别及遗传信息的深入研究。根据本发明方法制成的真菌检测试剂盒可广 泛应用于工业生产、环境监测、空气检测、±壤检测、水质检测、食品检测、药品检测、化妆品 检测、保健品检测W及医学检测等多种领域。本发明技术的推广应用将会具有良好的市场 前景并产生可观的经济及社会效益。
【附图说明】
[0化5] 图1为DNA质控检测电泳图，其中：为DNA marker, 1-3号为可建库的曲NA阳性对 照，4-6号为本实验提取的真菌单细胞曲NA,样本和阳性对照的DNA都有>10化明显条带。
【具体实施方式】
[0056] W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所掲露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可W通过另外不同的具体实 施方式加 W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0057] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"运个"包括复数形式。
[0058] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。实施例1
[0059] 1.微量格特隐球菌细胞的获取:显微涂片、激光切割，获得单个目的细胞
[0060] 将微量样本涂于激光显微切割覆膜载玻片化eica Membrane Slides阳N2.0微米 或类似产品），用激光显微切割系统化eica LMD7000或类似产品）在63倍放大下找到目的细 胞，用激光强度40微焦(可设范围laser power 40 + 3)对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，落于无菌的离屯、小管中，重复上述操作共获取10个真菌细胞(可获取细胞数范围 1-100个）。
[0061] 2.格特隐球菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质
[0062] 1)将20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述离屯、管中，在4°C条件下浸泡细胞2小 时；
[0063] 2)配制复合预处理剂100ml:将50mM Tris，5mM邸TA，5%0-琉基乙醇混合均匀；
[0064] 3)配制混合酶处理剂Iml:蜗牛酶6mg/mL，溶壁酶4mg/ni;
[0(?日]4)加入20化1复合预处理剂于离屯、管中，35。(：处理细胞1小时；
[0066] 5) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0067] 6)加入20化1无菌水洗涂细胞两次，500化pm离屯、5min，弃去液体；
[006引 7)加入20化1混合酶处理剂，37 °C处理6小时；
[0069] 8)500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去液体；
[0070] 9)加入SOiil PBS洗涂细胞一次，500化pm离屯、5min，弃去液体，保留化1细胞悬液。
[0071] 3.微量格特隐球菌原生质曲NA的提取和扩增
[0072] 衔接步骤2中化1细胞悬液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德国Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混匀并瞬时离屯、，65°C解育IOmin;加入化1试剂盒中Stop Solution,混匀并 瞬时离屯、，暂时保存于冰上;每个扩增反应中加40iU PCR反应液(按试剂盒说明书配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 应8小时;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即为提取的格特隐球菌曲NA。
[0073] 上述10个格特隐球菌细胞的曲NA提取扩增后，经DNA质控检测达到二代测序建库 要求，0D260/0D280 :1.82，DNA浓度：75ngAU，完整性〉IOkb，如附图1所示，其中TT为DNA marker, 1-3号为可建库的曲NA阳性对照，4-6号为本实验提取的真菌单细胞曲NA,样本和阳 性对照的DNA都有>10化明显条带。W上结果说明单细胞的DNA提取扩增实验是成功的，符 合二代测序建库要求，可W进行全基因组测序。
[0074] 4.微量曲NA建库
[007引按照试剂盒NEBNex峨叫haDNA LibraiT Prep Kit forlllumi皿?(美国肥B公 司）对W上格特隐球菌曲NA进行建库。
[0076] 5.新一代基因组测序
[0077] 用Illumina MiSeq仪器及相应试剂（MiSeq 600 cycles Reagent V3美国 111皿ina公司）对W上建库的曲NA进行全基因组测序。
[0078] 6.生物信息学分析
[0079] 使用SPAdes软件对测序数据进行组装，得到组装结果与NCBI公开数据库nt库进行 比对，判定是格特隐球菌。
[0080] 实施例2
[0081 ] 1.微量都柏林念珠菌细胞的获取:显微涂片、激光切割，获得单个目的细胞
[0082] 将微量样本涂于激光显微切割覆膜载玻片化eica Membrane Slides阳N2.0微米 或类似产品），用激光显微切割系统化eica LMD7000或类似产品）在63倍放大下找到目的细 胞，用激光强度43微焦(可设范围laser power 40 + 3)对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，落于无菌的离屯、小管中，共获取1个真菌细胞(可获取细胞数范围1-100个）。
[0083] 2.都柏林念珠菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质
[0084] 1)将20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述离屯、管中，在4°C条件下浸泡细胞2小 时；
[0085] 2)配制复合预处理剂100mL:将50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均匀；
[0086] 3)配制混合酶处理剂Iml:蜗牛酶6mg/mL，溶菌酶4mg/ni;
[0087] 4)加入20化1复合预处理剂于离屯、管中，35°C处理细胞1小时；
[0088] 5) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0089] 6)加入20化1无菌水洗涂细胞两次，500化pm离屯、5min，弃去液体；
[0090] 7)加入20化1混合酶处理剂，45°C处理10小时；
[0091] 8) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去液体；
[0092] 9)加入SOiil PBS洗涂细胞一次，500化pm离屯、5min，弃去液体，保留化1细胞悬液。
[0093] 3.微量都柏林念珠菌原生质曲NA的提取和扩增
[0094] 衔接步骤2中扣1细胞悬液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德国Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混匀并瞬时离屯、，65°C解育IOmin;加入化1试剂盒中Stop Solution,混匀并 瞬时离屯、，暂时保存于冰上;每个扩增反应中加40iU PCR反应液(按试剂盒说明书配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 应8小时;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即为提取的都柏林念珠菌曲NA。
[0095] 4.微量曲NA建库
[0096] 按照试剂盒NEBNext?UltraDNA Libra巧 Prep Kit formumina⑥（美国肥B公 司）对W上都柏林念珠菌曲NA进行建库。
[0097] 5.新一代基因组测序
[009引 用Illumina MiSeq仪器及相应试剂（MiSeq 600 cycles Reagent V3美国 111皿ina公司）对W上建库的曲NA进行全基因组测序。
[0099] 6.生物信息学分析
[0100] 使用SPAdes软件对测序数据进行组装，得到组装结果与NCBI公开数据库nt库进行 比对，判定是都柏林念珠菌。
[0101] 实施例3
[0102] 1.微量马拉色菌细胞的获取:显微涂片、激光切割，获得单个目的细胞
[0103] 将微量样本涂于激光显微切割覆膜载玻片化eica Membrane Slides阳N2.0微米 或类似产品），用激光显微切割系统化eica LMD7000或类似产品）在63倍放大下找到目的细 胞，用激光强度38微焦(可设范围laser power 40 + 3)对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，落于无菌的离屯、小管中，重复上述操作共获取60个真菌细胞(可获取细胞数范围 1-100个）。
[0104] 2.马拉色菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质
[01化]1)将20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述离屯、管中，在4°C条件下浸泡细胞2小 时；
[0106] 2)配制复合预处理剂100mL:将50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均匀；
[01 07] 3)配制混合酶处理剂Iml:蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶4mg/mL，溶菌酶4mg/ni;
[0108] 4)加入20化1复合预处理剂于离屯、管中，35°C处理细胞1小时；
[0109] 5) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0110] 6)加入20化1无菌水洗涂细胞两次，500化pm离屯、5min，弃去液体；
[0111] 7)加入20化1混合酶处理剂，35 °C处理8小时；
[0112] 8) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去液体；
[0113] 9)加入50iil PBS洗涂细胞一次，500化pm离屯、5min，弃去液体，保留化I细胞悬液。
[0114] 3.微量马拉色菌原生质曲NA的提取和扩增
[0115] 衔接步骤2中化1细胞悬液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德国Qiagen公司）中3 iil Buffer D2,混匀并瞬时离屯、，65°C解育IOmin;加入化1试剂盒中Stop Solution,混匀并 瞬时离屯、，暂时保存于冰上;每个扩增反应中加40iU PCR反应液(按试剂盒说明书配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 应8小时;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即为提取的马拉色菌曲NA。
[0116] 4.微量曲NA建库
[0117] 按照试剂盒NEBN放t?叫traDNA LibraiT Prep Kit fo;rI.llumina?(美国肥B公 司）对W上马拉色菌曲NA进行建库。
[0118] 5.新一代基因组测序
[0119] 用Illumina MiSeq仪器及相应试剂(MiSeq 600巧cles Reagent V3美国Illumina 公司）对W上建库的曲NA进行全基因组测序。
[0120] 6.生物信息学分析
[0121] 使用SPAdes软件对测序数据进行组装，得到组装结果与NCBI公开数据库nt库进行 比对，判定是马拉色菌。
[0122] 实施例4
[0123] 1.微量伊蒙菌细胞的获取:显微涂片、激光切割，获得单个目的细胞
[0124] 将微量样本涂于激光显微切割覆膜载玻片化eica Membrane Slides阳N2.0微米 或类似产品），用激光显微切割系统化eica LMD7000或类似产品）在63倍放大下找到目的细 胞，用激光强度40微焦(可设范围laser power 40 + 3)对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，落于无菌的离屯、小管中，重复上述操作共获取20个真菌细胞(可获取细胞数范围 1-100个）。
[0125] 2.伊蒙菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质
[01%] 1)将20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述离屯、管中，在4°C条件下浸泡细胞2小 时；
[0127] 2)配制复合预处理剂100mL:将50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均匀；
[01 %] 3)配制混合酶处理剂Iml:蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶3mg/mL，纤维素酶3mg/ml^;
[01巧]4)加入20化1复合预处理剂于离屯、管中，35°C处理细胞1小时；
[0130] 5) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0131 ] 6)加入20化1无菌水洗涂细胞两次，500化pm离屯、5min，弃去液体；
[0132] 7)加入20化1混合酶处理剂，37°C处理3小时；
[0133] 8) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去液体；
[0134] 9)加入SOiil PBS洗涂细胞一次，500化pm离屯、5min，弃去液体，保留化1细胞悬液。
[0135] 3.微量伊蒙菌原生质曲NA的提取和扩增
[0136] 衔接步骤2中化1细胞悬液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德国Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混匀并瞬时离屯、，65°C解育IOmin;加入化1试剂盒中Stop Solution,混匀并 瞬时离屯、，暂时保存于冰上;每个扩增反应中加40iU PCR反应液(按试剂盒说明书配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 应8小时;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即为提取的伊蒙菌曲NA。
[0137] 4.微量曲NA建库
[013引 按照试剂盒NEBNex喚叫化aDNA Libra巧Prep Kit formumha?(美国肥B公 司）对W上伊蒙菌曲NA进行建库。
[0139] 5.新一代基因组测序
[0140] 用Illumina MiSeq仪器及相应试剂（MiSeq 600 cycles Reagent V3美国 111皿ina公司）对W上建库的曲NA进行全基因组测序。
[0141] 6.生物信息学分析
[0142] 使用SPAdes软件对测序数据进行组装，得到组装结果与NCBI公开数据库nt库进行 比对，判定是伊蒙菌。
[0143] 实施例5
[0144] 1.微量黑曲霉细胞的获取:显微涂片、激光切割，获得单个目的细胞
[0145] 将微量样本涂于激光显微切割覆膜载玻片化eica Membrane Slides阳N2.0微米 或类似产品），用激光显微切割系统化eica LMD7000或类似产品）在63倍放大下找到目的细 胞，用激光强度37微焦(可设范围laser power 40 + 3)对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，落于无菌的离屯、小管中，重复上述操作共获取100个真菌细胞(可获取细胞数范 围1-100个)。
[0146] 2.黑曲霉细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质
[0147] 1)将20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述离屯、管中，在4°C条件下浸泡细胞2小 时；
[014引 2)配制复合预处理剂100mL:将50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均匀；
[0149] 3)配制混合酶处理剂Iml:蜗牛酶4mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纤维素酶3mg/mL
[0150] 4)加入20化1复合预处理剂于离屯、管中，35。(：处理细胞1小时；
[0151] 5) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0152] 6)加入20化1无菌水洗涂细胞两次，500化pm离屯、5min，弃去液体；
[0153] 7)加入20化1混合酶处理剂，37 °C处理12小时；
[0154] 8) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去液体；
[0巧日]9)加入SOiil PBS洗涂细胞一次，500化pm离屯、5min，弃去液体，保留祉1细胞悬液。
[0156] 3.微量黑曲霉原生质曲NA的提取和扩增
[0157] 衔接步骤2中祉1细胞悬液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德国Qiagen公司）中3 iil Buffer D2,混匀并瞬时离屯、，65°C解育IOmin;加入化1试剂盒中Stop Solution,混匀并 瞬时离屯、，暂时保存于冰上;每个扩增反应中加40iU PCR反应液(按试剂盒说明书配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 应8小时；于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即为提取的黑曲霉曲NA。
[015引 4.微量曲NA建库
[0159] 按照试剂盒NEHNext?叫haDNA LibraiT Prep Kit forlllu拍虹a霞（美国肥B公 司）对W上黑曲霉曲NA进行建库。
[0160] 5.新一代基因组测序
[0161] 用Illumina MiSeq仪器及相应试剂（MiSeq 600 cycles Reagent V3美国 111皿ina公司）对W上建库的曲NA进行全基因组测序。
[0162] 6.生物信息学分析
[0163] 使用SPAdes软件对测序数据进行组装，得到组装结果与NCBI公开数据库nt库进行 比对，判定是黑曲霉。
[0164] 实施例6
[0165] 1.微量皮炎芽生菌细胞的获取:显微涂片、激光切割，获得单个目的细胞
[0166] 将微量样本涂于激光显微切割覆膜载玻片化eica Membrane Slides阳N2.0微米 或类似产品），用激光显微切割系统化eica LMD7000或类似产品）在63倍放大下找到目的细 胞，用激光强度42微焦(可设范围laser power 40 + 3)对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，落于无菌的离屯、小管中，重复上述操作共获取30个真菌细胞(可获取细胞数范围 1-100个）。2.皮炎芽生菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质
[0167] 1)将20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述离屯、管中，在4°C条件下浸泡细胞2小 时；
[016引 2)配制复合预处理剂100mL:将50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均匀；
[0169] 3)配制混合酶处理剂Iml:溶壁酶5mg/mL，溶菌酶4mg/mL，纤维素酶3mg/mL
[0170] 4)加入20化1复合预处理剂于离屯、管中，35°C处理细胞1小时；
[0171] 5) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0172] 6)加入20化1无菌水洗涂细胞两次，500化pm离屯、5min，弃去液体；
[0173] 7)加入20化1混合酶处理剂，37°C处理6小时；
[0174] 8) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去液体；
[01巧]9)加入SOiil PBS洗涂细胞一次，500化pm离屯、5min，弃去液体，保留IOiil细胞悬液。
[0176] 3.微量皮炎芽生菌原生质曲NA的提取和扩增
[0177] 衔接步骤2中10山细胞悬液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德国Qiagen公司）中 化IBuffer D2,混匀并瞬时离屯、，65°C解育IOmin;加入化1试剂盒中Stop Solution,混匀并 瞬时离屯、，暂时保存于冰上;每个扩增反应中加40iU PCR反应液(按试剂盒说明书配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 应8小时;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即为提取的皮炎芽生菌曲NA。
[017引 4.微量曲NA建库
[0179] 按照试剂盒NEBN巧㈱UltraDNA Libra巧 Prep Kit forlllumina⑥（美国肥B公 司）对W上皮炎芽生菌曲NA进行建库。
[0180] 5.新一代基因组测序
[0181] 用Illumina MiSeq仪器及相应试剂（MiSeq 600 cycles Reagent V3美国 111皿ina公司）对W上建库的曲NA进行全基因组测序。
[0182] 6.生物信息学分析
[0183] 使用SPAdes软件对测序数据进行组装，得到组装结果与NCBI公开数据库nt库进行 比对，判定是皮炎芽生菌。
[0184] 实施例7
[0185] 1.微量粗球抱子菌细胞的获取:显微涂片、激光切割，获得单个目的细胞
[01化]将微量样本涂于激光显微切割覆膜载玻片化eica Membrane Slides阳N2.0微米 或类似产品），用激光显微切割系统化eica LMD7000或类似产品）在63倍放大下找到目的细 胞，用激光强度40微焦(可设范围laser power 40 + 3)对所选出的单个真菌细胞进行激光 显微切割，落于无菌的离屯、小管中，重复上述操作共获取5个真菌细胞(可获取细胞数范围 1-100个）。
[0187] 2.粗球抱子菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质
[0188] 1)将20化1 0.8M D-山梨醇溶液加入到上述离屯、管中，在4°C条件下浸泡细胞2小 时；
[0189] 2)配制复合预处理剂100mL:将50mM Tris,5mM邸TA,5%e-琉基乙醇混合均匀；
[0190] 3)配制混合酶处理剂Iml:蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶2mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纤维素酶 4mg/mL；
[0191] 4)加入200til复合预处理剂于离屯、管中，35它处理细胞1小时；
[0192] 5) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去处理剂；
[0193] 6)加入20化1无菌水洗涂细胞两次，500化pm离屯、5min，弃去液体；
[0194] 7)加入20化1混合酶处理剂，37 °C处理6小时；
[01巧]8) 500化pm离屯、5min将细胞收集至管底，弃去液体；
[0196] 9)加入SOiil PBS洗涂细胞一次，500化pm离屯、5min，弃去液体，保留化1细胞悬液。
[0197] 3.微量粗球抱子菌原生质曲NA的提取和扩增
[019引衔接步骤2中化1细胞悬液，加入RE化I-g Single Cell Kit(德国Qiagen公司）中3 iil BufferD2,混匀并瞬时离屯、，65°C解育IOmin;加入化1试剂盒中Stop Solution,混匀并 瞬时离屯、，暂时保存于冰上;每个扩增反应中加40iU PCR反应液(按试剂盒说明书配制:此0 SC 化1，RE化I-g SC Reaction Buffer 2化1，RE化I-g SC DNA Polymerase 2]il)，30°C反 应8小时;于65°C3min下使RE化I-g DNA聚合酶失活，即为提取的粗球抱子菌曲NA。
[0199] 4.微量曲NA建库
[0200] 按照试剂盒NEBN株炮叫haDNA Library Prep Kit foril山虹ina?(美国肥B公 司）对W上粗球抱子菌曲NA进行建库。
[0201] 5.新一代基因组测序
[0202] 用Illumina MiSeq仪器及相应试剂（MiSeq 600 cycles Reagent V3美国 111皿ina公司）对W上建库的曲NA进行全基因组测序。
[0203] 6.生物信息学分析
[0204] 使用SPAdes软件对测序数据进行组装，得到组装结果与NCBI公开数据库nt库进行 比对，判定是粗球抱子菌。
【主权项】
1. 一种利用单细胞测序检测微量真菌的方法，包括以下步骤： (1) 微量真菌细胞的获取:将微量真菌样本涂于激光显微切割覆膜载玻片上，用激光显 微切割系统找到目的细胞，用激光强度37-43微焦对所选出的单个真菌细胞进行激光显微 切割，获得单个目的细胞，重复上述操作获取总数为1-100个的目的细胞； (2) 真菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质； 1) 将0.8M D-山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离心管中，在4°C条件下浸泡目的 细胞2小时； 2) 配制复合预处理剂:将50mM Tris，5mM EDTA，5%0-巯基乙醇混合均匀； 3) 配制混合酶处理剂:将蜗牛酶1-lOmg/mL，溶壁酶1-lOmg/mL，溶菌酶1-lOmg/mL，纤维 素酶1-lOmg/mL四种酶中的至少两种酶按一定比例混合，当所述混合酶处理剂仅由两种酶 混合组成时，其中至少包括蜗牛酶和溶壁酶中的一种； 4) 将上述复合预处理剂加入装有目的细胞的离心管中，35°C处理细胞1小时； 5) 上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去处理剂； 6) 向上述离心管中加入无菌水洗涤细胞两次，离心，弃去液体； 7) 向上述离心管中加入混合酶处理剂，35-45°C处理3-12小时； 8) 上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去液体； 9) 向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留4-10μ1细胞悬液； (3) 微量真菌原生质gDNA的提取和扩增：利用单细胞全基因组扩增试剂盒对上述步骤 中获得的4-10μ1细胞悬液进行核酸提取及扩增反应，获得上述真菌gDNA; (4) 微量gDNA建库:利用DNA建库试剂盒对上述真菌gDNA进行建库； (5) 基因组测序:对上述建库的真菌gDNA进行全基因组测序； (6) 生物信息学分析:利用相关软件对测序获得的数据进行组装，得到组装结果与相关 公开数据库进行比对，判定所检测真菌的种类。2. 如权利要求1所述利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于:所述真菌包括 念珠菌属中的白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念 珠菌；曲霉属中的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、焦曲霉;隐球菌属中的新生隐 球菌、格特隐球菌以及上述各菌种的变种。3. 如权利要求1所述利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于:所述真菌包括 马拉色菌。4. 如权利要求1所述利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于:所述真菌包括 组织胞浆菌、伊蒙菌、申克氏孢子丝菌、马尔尼菲青霉、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、粗球 孢子菌。5. 如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步骤如下： (2)真菌细胞壁破壁:化学法与混合酶法结合提取真菌原生质； 1) 将0.8M D-山梨醇溶液加入到装有上述目的细胞的离心管中，在4°C条件下浸泡目的 细胞2小时； 2) 配制复合预处理剂:将50mM Tris，5mM EDTA，5%0-巯基乙醇混合均匀； 3) 配制混合酶处理剂:蜗牛酶6mg/mL，溶壁酶4mg/mL; 4) 将上述复合预处理剂加入装有目的细胞的离心管中，35°C处理细胞1小时； 5) 上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去处理剂； 6) 向上述离心管中加入无菌水洗涤细胞两次，离心，弃去液体； 7) 向上述离心管中加入混合酶处理剂，37 °C处理6小时； 8) 上述离心管经离心后将细胞收集至管底，弃去液体； 9) 向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留4μ1细胞悬液。6. 如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步骤优选如下： 3)配制混合酶处理剂:蜗牛酶6mg/mL，溶菌酶4mg/mL; 7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，45 °C处理10小时； 9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留5μ1细胞悬液。7. 如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步骤优选如下： 3)配制混合酶处理剂:蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶4mg/mL，溶菌酶4mg/mL; 7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，35 °C处理8小时； 9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留6μ1细胞悬液。8. 如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步骤优选如下： 3)配制混合酶处理剂:蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶3mg/mL，纤维素酶3mg/mL; 7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，37 °C处理3小时； 9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留6μ1细胞悬液。9. 如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在于： 其中的第(2)步骤优选如下： 3)配制混合酶处理剂:蜗牛酶4mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纤维素酶3mg/mL; 7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，37 °C处理12小时； 9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留8μ1细胞悬液。10. 如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在 于:其中的第(2)步骤优选如下： 3)配制混合酶处理剂:溶壁酶5mg/mL，溶菌酶4mg/mL，纤维素酶3mg/mL; 7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，37 °C处理6小时； 9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留10μ1细胞悬液。11. 如权利要求1-4中任一项所述的利用单细胞测序检测微量真菌的方法，其特征在 于:其中的第(2)步骤优选如下： 3)配制混合酶处理剂:蜗牛酶4mg/mL，溶壁酶2mg/mL，溶菌酶3mg/mL，纤维素酶4mg/mL; 7)向上述离心管中加入混合酶处理剂，37 °C处理6小时； 9)向上述离心管中加入PBS洗涤细胞一次，离心，弃去液体，保留6μ1细胞悬液。12. -种根据权利要求1所述利用单细胞测序检测微量真菌的方法制成的真菌检测试 剂盒，所述真菌检测试剂盒适用于以下领域:工业生产、环境监测、空气检测、土壤检测、水 质检测、食品检测、药品检测、化妆品检测、保健品检测以及医学检测。
【文档编号】C12Q1/04GK105925720SQ201610535044
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】杨英, 王升启, 周喆, 王澎, 李珍, 李宗玮
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所