一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母，是一种以出 芽生殖为主的单细胞真菌。酿酒酵母是与人类关系最为密切的微生物，酵母工业其具有特 殊的优越性。因为酿酒酵母生长繁殖快，酶活性较强，生产蛋白和生物活性物质的速率是动 植物所不能比拟的。其次，酵母营养丰富，每克干酵母中含有蛋白质50%~60%、碳水化合 物30%~35%、核糖核酸4. 5%~8. 3%、脂肪1 %~5%。此外，还含有丰富的维生素、矿物 质、氨基酸等其它的营养成分。第三，酵母菌生产不受季节、气候和地区的限制，生产稳定， 发酵产泡沫少，能抗重金属，环境适应性强。
[0003] 酿酒酵母现已经广泛应用于食品、制药和饲料等领域。食品行业中活性干酵母用 于制作面包和馒头；性状优良的酿酒酵母用于酿造啤酒、白酒和葡萄酒；制作酵母天然调 味品、酵母蛋白肽等。在生物制药行业，废酵母泥用于转化生产1，6-二磷酸果糖和三磷酸 核苷；酵母高密度发酵提取谷胱甘肽、麦角固醇等活性物质。饲料行业利用废酵母泥生产培 养微生物的酵母浸膏和酵母提取物，同时酵母菌是用于配制畜类、鱼虾、珍贵毛皮动物的理 想蛋白质原料。
[0004] 由于酿酒酵母的广泛应用，利用新的发酵工艺对酿酒酵母进行高密度发酵，得到 生产成本低廉、质量稳定的酿酒酵母是势在必行的。
[0005] 酵母菌的高密度发酵是一个相对概念，一般指发酵液中酵母浓度在30g/L以上。 营养供给不适宜、发酵液中溶解氧不足、生产抑制性物质的积累和发酵液流变学特性的影 响都会限制酵母在发酵液中的积累。
[0006] 在高密度发酵时，随着菌体的大量积累，发酵液粘度大幅度增加，为非牛顿型流 体，对氧的传递和营养物的传质都产生较大影响。改变这种现象需要通过改变发酵罐的结 构来实现。因此在酵母常规发酵过程中，需要采用精细化的补料策略，才能实现酵母快速生 长和生物量的积累。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种实现酿酒酵母高密度发酵的方法。在发酵前期，利用溶 氧的变化来调节补加培养基的速率，维持菌体生长所需要的营养物质，发酵后期菌体生长 变慢，葡萄糖的利用速率降低，此时逐步降低补料速率，延长发酵周期；在整个发酵过程中 随着酿酒酵母代谢活跃度增加，菌体量不断积累，逐步提高搅拌速率和通气量，能够保证足 够的通风，从而实现酵母菌稳定快速的高密度发酵。使用购自中国工业微生物菌种保藏管 理中心的CICC编号为1511或32280的酿酒酵母进行高密度发酵，均得到较好的实验结果
[0008] 所述方法，是在酵母发酵培养过程中分阶段控制培养基补料速率，前期不补料，中 期逐步提高补料速度，后期逐步降低补料速度，同时在中期逐步提高搅拌速率和通气量。
[0009] 所述方法是：（1)将酵母种子液接入发酵罐中，初始转速为400rpm，初始通气量为 4. 5L/min ; (2)当葡萄糖耗尽、溶氧突然提高至30%以上时，开始以8-16mL/h的速率进行补 料，并逐步提高补料速率、搅拌速率和通气量，直至补料速率提高到80-85mL/h、搅拌速率和 通气量提高到发酵设备所能达到的最大搅拌速率和通气量；（3)当酵母生长速率持续降低 达2h以上时，逐步降低补料速率直至发酵结束。
[0010] 所述逐步提尚补料速率，在本发明的一种实施方式中，是指每4h提尚14-25mL/h。
[0011] 所述酵母生长速率持续降低达2h以上时，在本发明的一种实施方式中，是指发酵 28h 时。
[0012] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括如下步骤：（1)将酵母种子液接入发 酵罐中，初始转速为400rpm，初始通气量为4. 5L/min，发酵培养IOh ; (2) IOh后以8-16mL/ h的速率进行补料，并每4h提高补料速率14-25mL/h ;同时每隔4h将搅拌速率提高IOOrpm 直至达到发酵设备所能达到的最大搅拌速率，每隔4-8h将通气量提高I. 5-3L/min直至达 到发酵设备所能达到的最大通气量；(3)保持最大搅拌速率和通气量进行发酵，当发酵28h 后，按照每4h的降低10-20mL/h的速度逐步降低补料速率，发酵32-36h即停止发酵。
[0013] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：（1)种子液按10%接种量接种于 发酵罐中进行发酵，培养温度为30°C，控制pH为5. 5,初始转速为400rpm，初始通气量为 4. 5L/min ; (2)发酵IOh后开始以8mL/h速率开始补料，当溶氧突然提高至30 %以上时增加 补料速率，按每4h提高补料速率14-25mL/h直至提高至80-85mL/h ;同时每隔4h将搅拌速 率提高lOOrpm，直至26h搅拌调至800rpm ;发酵14h后将通气量提高至6L/min，发酵22h后 将通气量提高至9L/min ; (3)发酵28h后，按照每4h降低10-20mL/h的速度降低补料速率， 发酵32-36h即发酵结束。
[0014] 所述发酵结束，在本发明的一种实施方式中，是发酵34h即结束发酵。
[0015] 所述酿酒酵母，在本发明的一种实施方式中，是购自中国工业微生物菌种保藏管 理中心的CICC编号为1511或32280的酿酒酵母。本发明的方法对酿酒酵母具有普适性， 不仅仅局限于这两株菌。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] (1)分两阶段控制培养基补料速率，发酵中期根据溶氧变化进行补料速率的逐步 提高，发酵后期根据酵母生长速率逐步降低补料速率；通过逐步提高搅拌速率和通气量，实 现酿酒酵母快速稳定的生长，常规酵母高密度发酵周期一般在40h以上，本发明采用34h即 可，发酵周期短，提高了发酵罐利用率，降低了能耗，减少了染菌机会；
[0018] (2)发酵控制策略简单，通过溶氧和生长速率（OD)变化来控制搅拌转速、通气量、 补料速率即可，不需要其他特殊检测装置，比如残糖检测、乙醇监测、尾气分析等装置，对 发酵设备要求低，一般工厂的普通发酵设备即可实现高密度发酵，可避免设备改造，降低成 本。同时培养基成分简单，价格低廉，有利于控制成本。
[0019] (3)该发明所提供的方法对于酿酒酵母具有普适性，得到酿酒酵母产量可达 109.2g/L〇
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1中酿酒酵母（CICC 1511)发酵过程曲线图；其中，▲为发酵液的酵 过程中葡萄糖浓度变化曲线，为发酵过程中酿酒酵母细胞干重的变化曲线，?为发酵过 程中发酵液中的乙醇浓度变化曲线；
[0021] 图2为实施例2中酿酒酵母（CICC 1511)发酵过程曲线；其中不同曲线表征的发 酵过程参数同图1 ;
[0022] 图3为实施例3中酿酒酵母（CICC 1511)发酵过程曲线；其中不同曲线表征的发 酵过程参数同图1 ;
[0023] 图4为实施例4中酿酒酵母（CICC 1511)高密度发酵的发酵过程曲线；其中不同 曲线表征的发酵过程参数同图1 ;
[0024] 图5为实施例5中酿酒酵母（CICC 32280)高密度发酵的发酵过程曲线；其中不同 曲线表征的发酵过程参数同图1。
【具体实施方式】
[0025] 斜面保藏培养基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10,琼脂25。
[0026] 种子培养基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10。
[0027] 发酵培养基（g/L):工业葡萄糖65,尿素1. 8,工业玉米粉10, KH2PO4 10, MgSO4 4， ZnSO4 10mg/L, FeSO4 12mg/L, MnSO4 2mg/L〇
[0028] 补料培养基：500g/L葡萄糖溶液。
[0029] 实施例1 :
[0030] 取酿酒酵母CICC 1511，按以下方法制备种子液：
[0031] (1)种子培养基配置完成，分装于500mL摇瓶中，115°C灭菌20min，冷却至室温。
[0032] (2)取一环保存于斜面培养基中的酿酒酵母菌，接种于种子培养基中，培养温度为 30°C，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养24h。
[0033] (3) 7L罐中使用4种不同的发酵培养基和补料培养基，培养基成分如下：