一株产角鲨烯酵母的分离鉴定和酵母中角鲨烯的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海洋天然活性物质技术领域，是从一种海洋酵母体中分离得到角鲨烯活性物质及其制备方法。
【背景技术】
[0002]角鲨烯又名鲨烯、三十碳六烯、鱼肝油萜，化学名为2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，是一种高度不饱和烃类化合物，具有提高体内超氧化物歧化酶(S0D)活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种无毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物质。
[0003]由于具有上述功能和用途，而且至今未能找到替代品，对角鲨烯的开发利用一直是海洋生物产业的研究热点，多年来研究报道从未间断。现角鲨烯主要从深海鲨鱼的肝油中提取，提取率一般为肝油的15%?69%，但由于资源稀少，产量受到限制。
[0004]为解决资源稀少的难题，广大科学家一直在寻找角鲨烯的新来源。主要有三个途径，寻找新的原材料、利用化学方法人工合成和通过微生物发酵生产。寻找新原材料方面，已对许多种高等生物的角鲨烯含量进行分析，研究结果表明:除了一些珍贵动物，如水獭、海狸、密熊、鼹鼠等的表皮脂肪含量较高外，其余高等生物体的含量一般很少，没有工业利用价值，表明从深海鲨鱼以外的其它高等生物体获得新生产原材料的可能性很小；从角鲨烯的人工合成的研究进展看，化学法人工合成角鲨烯的难度较大，尚未找到技术突破口 ；在利用微生物发酵生产角鲨烯方面的研究工作尚试验阶段。目前世界利用菌株提取角鲨烯的最高水平也仅为0.43mg/g,是印度学者Bhattacharjee和Singhal于2001年利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和从糖蜜分离得到的一株酵母(Torulaspora delbrueckii)发酵生产而得的。
[0005]本发明利用在分离得到的热带假丝酵母生产角鲨烯，在培养基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L蔗糖时，生产出的角鲨烯含量为2.38mg/g。
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种酵母高产角鲨烯的方法。本发明生产的角鲨烯具有可再生性，对保护鲨鱼等珍稀动物具有重要意义。
【具体实施方式】
[0007]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0008]实施例
[0009]生产本发明角鲨烯(C3qH50)
[0010]从红树林白骨壤生长的高潮带中采集土壤样品，将Ig 土壤样品接种于10ml的YPD培养基中含(400mg/L头孢霉素)，培养72h，分别吸取稀释倍数为105、106、107、108的菌体溶6DB20.1mL作平板涂布培养，每个稀释倍数做三块平板培养72h。把培养好的平板，挑出来做平板画线分离，再培养然后观察在同一块平板内菌种是不是已单一化，如果没有继续做平板画线分离，一直到菌种单一化为止，最后选取得到一株热带假丝酵母。
[0011]配制720mL液体种子培养基，分装到6个250mL的三角瓶中，每瓶约120mL。121°C灭菌15min，冷却至室温，将热带假丝酵母接入其中。在恒温震荡器中，于200r/min，25°C条件下培养3天左右。得到720mL种子培养液。
[0012]配制5L的液体培养基:蛋白胨100g，酵母提取物50g，蔗糖100g，陈海水5L，用氢氧化钠调节PH值至7.4左右。分装入32个250mL(加入量约150mL)的三角瓶中，加上硅胶塞，121°C灭菌20min，自然冷却至室温，每瓶接2mL种子培养液。200r/min、25°C下摇床发酵培养2天，得5L发酵液。
[0013]发酵液先用高压剪切破碎仪做细胞破碎处理，将菌体破碎，然后用离心机离心除去发酵液，收集菌体。
[0014]收集的菌体在60°C下烘干，称取约10g的菌体，用滤纸包裹装入索氏提取器内，同时控制水浴温度为70°C，加入200ml石油醚回流加热4h。石油醚层用旋转蒸发器旋转蒸发去除，最后以真空泵抽真空，至溶剂全部出去，得到2g左右淡黄色菌株液体油A。
[0015]取收集得到的淡黄色菌株液体油A，加入硅胶层析柱中(称取硅胶400g，力口入氯仿500ml，不断搅拌待空气除去，混合均匀。将上述吸附着氯仿的硅胶湿法装柱(40mmX800mm)，不断轻敲管壁，使硅胶压紧，采用加压的方法，使柱内硅胶均匀、紧密)，先以石油醚洗脱，洗脱液约为柱体积的两倍，然后以石油醚/乙醚进行梯度洗脱，洗脱梯度为30/1?1/1，后以氯仿/甲醇进行梯度洗净柱体，洗脱梯度为20/1?1/1。以50ml为单位收集柱流液，收集合并10?18顺序号流液(BI?B8)，加热除去溶剂，得到淡黄色液体C。
[0016]将分离得到淡黄色液体C用乙腈溶解，通过半制备型液相色谱采用乙腈进行分离，得到化合物I (238mg)。化合物I经液相色谱仪检测，保留时间和角鲨烯标准品相同，说明化合物I是角鲨烯物质。
【主权项】
1.一株热带假丝酵母菌株的分离，该方法包括以下步骤: (1)从红树林白骨壤生长的高潮带中采集土壤样品，将土壤样品接种于培养基中，培养I?7天； (2)取稀释好的菌体溶作平板涂布培养，培养I?7天； (3)把培养好的平板，挑出来做平板画线分离，一直到菌种单一化为止，选取得到一株产角鲨烯的热带假丝酵母。2.权利要求1所述的热带假丝酵母种子培育，该方法包括以下步骤:配制液体种子培养基，装到三角瓶中，经过灭菌，冷却，将权利要求1得到的热带假丝酵母接入其中，在恒温震荡器中培养3?5天。3.权利要求2所述的热带假丝酵母发酵，该方法包括以下步骤:配制液体培养基，装入三角瓶中，灭菌，冷却，接入权利要求2所述的种子培养液，发酵培养I?7天。4.权利要求3所述的发酵液提取角鲨烯物质，制备步骤如下: (1)权利要求3所述的发酵液做细胞破碎处理，收集菌体； (2)收集步骤(I)得到菌体，用滤纸包裹装入索氏提取器内，用氯仿、乙腈、石油醚进行提取，得到淡黄色菌株液体油。 (3)取步骤(2)得到的淡黄色菌株液体油，加入硅胶层析柱中，用氯仿、乙腈、石油醚洗脱液进行洗脱，收集流出组分，加热除去溶剂，得到淡黄色液体。 (4)将步骤(3)分离得到淡黄色液体用乙腈溶解，通过半制备型HPLC进行分离，得到角鲨烯物质。
【专利摘要】本发明公开了酵母中角鲨烯的制备方法。本发明利用从红树林土壤中分离得到的一株含角鲨烯活性物质的海洋热带假丝酵母菌株，发明了石油醚溶剂从海洋热带假丝酵母中提取分离角鲨烯的步骤，同时本发明提供了利用层析柱和半制备液相色谱仪纯化角鲨烯的方法。提取纯化的角鲨烯经气相色谱-质谱法、红外法和液相色谱法鉴定，和角鲨烯标准品有着相同的图谱。本发明为提取和生产角鲨烯提供了新的途径，对保护鲨鱼等珍稀资源具有重要意义，为开发利用海洋微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。
【IPC分类】C07C11/21, C12R1/74, C12N1/16, C07C7/00
【公开号】CN105018356
【申请号】CN201410157867
【发明人】雷富, 何小英, 陈宪云, 姜发军, 陈小玲, 李检秀, 孙靓, 彭元
【申请人】广西科学院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月21日