专利名称：一种混合脱氮微生物菌群的高密度培养方法
技术领域：
本发明目的是提供一种混合脱氮微生物菌群的高密度培养方法。 背景技术：
随着科学技术的快速进步和工业化的飞速发展，人民的生活水平日益提高，但同 时大量产生含氮废水，带来了一系列的环境问题。国内外目前处理含氮废水的处理方法，主要有吹脱法、气提回收法、化学沉淀法、 离子交换法、电化学氧化法和折点加氯法等。各种方法都存在一些问题，诸如处理效果不 佳，工艺复杂，工况难以掌握和处理成本偏高。相比之下，生物脱氮法较为经济有效。生物脱 氮剂是专门用于出去水中氨氮的一种生物强化制剂，为了能降低生产成本，提高生产效率， 该专利突破性的将高密度发酵技术应用于混合脱氮微生物，达到良好的效果。自然环境或者生物处理体系中，微生物通过自身的生命活动降解污染物，将有害 物质分解为稳定无害的小分子物质，如CO2和H2O。随着工业的发展，一些有毒有害物质的 排放会对环境微生物产生一定的毒害作用，使得生物降解体系中缺乏足够的微生物降解相 应的污染物，或抑制具有降解复杂污染物性能的微生物生长，需要很长一段时间才能通过 酶的诱导、遗传物质转移等方式使微生物逐渐适应。有效微生物的数量化技术是向传统的 生物处理系统中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的浓度，增强对难降解污染 物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物处理体系对目标污染物的去除效能。目前采用的比较传统的脱氮技术，有一个技术瓶颈，硝化菌群增殖速度慢且难以 维持较高的生物浓度，造成总水力停留时间较长，有机负荷较低，从而增加了投资和运行成 本。而且，生物脱氮技术抗冲击能力弱，高浓度氨氮和亚硝酸盐进水会抑制硝化菌的生长。专利号CN200510094737. 5的中国发明专利提供一种高密度细胞培养方法及其生 物反应装置，描述了一种细胞培养方法及其生物反应装置，尤其涉及一种细胞高密度循环 式或连续式培养方法及其生物反应装置，其特征是在生物反应器上加装无机膜过滤组件及 补料罐，并通过一定的控制回路将三者连接为一个可用于细胞循环式高密度培养或高密度 连续式培养的生物反应器系统。但是结构过于复杂，且关键的培养基差异，而且其运转工艺 流程并不适用于本发明中针对混合培养脱氮微生物的培育。专利申请号为CN200610039750. 5中国专利申请提供一种泡菜用乳酸菌的高密度 培养方法，提及了采用常规植物乳酸菌为菌种，经常规方法活化、扩大培养，接种于按常规 配方配置的发酵培养基，其特征在于将发酵培养基用含0. 2% 0. 3%柠檬酸钠、0. 2% 0.3%磷酸氢二钠、0. 0.2%磷酸二氢钠的缓冲盐溶液调pH值为6. 3 6.6 ；在整个培 养过程中，流加氨水以保持PH值稳定在5. 8 6. 2 ；菌液培养20h后，补加500ml 700ml 新鲜培养基；菌液培养结束后离心，加入由10% 15%脱脂乳、5% 7%谷氨酸钠、2% 3%甘油和7% 8%麦芽糖组成的复合保护剂，真空冷冻干燥。虽然也是采用高密度培养 方法，但是与培养脱氮微生物的各项技术指标都由明显差异。《混合脱氮微生物菌群的高密度培养》(耿金菊刘登如等)等相关文献中提到了高密度发酵培养混合脱氮微生物，利用微生物的混合培养技术，研究了好氧条件下同时硝 化_反硝化的生物脱氮过程。混合脱氮微生物菌群生长的适宜pH范围为7 10，在5L 发酵罐上探索了实现混合脱氮微生物菌群高密度培养的pH控制策略发酵前期补酸控制 PH ^ 8,发酵中后期不控制pH值，可缩短菌体的生长周期，提高菌体的氨氮降解速率，细胞 质量浓度达3. 9g/L，比自然pH条件下提高了 62. 5%。并在IOL发酵罐上作进一步的培养， 验证了其PH控制策略的可行性。通过分批补加(NH4)2SO4使菌浓进一步提高了 15.4%，最 终细胞干重为4. 5g/L。但其菌体浓度仍然较低，远达不到高浓度培养的要求。
发明内容
本发明目的是一种混合脱氮微生物菌群的高密度培养方法，通过连续流加硫酸 铵、琥珀酸钠，并维持磷酸缓冲液PH值为8，菌群培养时间24小时后，得到的脱氮菌群的细 胞干重即可达到20g/L。本发明采用的技术方案是一种混合脱氮微生物菌群的高密度培养方法，所述培养为好氧脱氮微生物菌群的 混合培养，本发明要点在于培养过程中维持PH为7. 0 8. 5，并在培养第5 10小时起 (优选从第5 7小时起)开始连续流加葡萄糖、硫酸铵和琥珀酸钠，维持培养基中葡萄糖 浓度为10 30g/L、硫酸铵浓度为5 25g/L、琥珀酸钠浓度为0. 5 5g/L，于28 32°C 下进行好氧培养获得混合脱氮微生物菌群。补料分批培养(又称流加培养)是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培 养的某些阶段以某种方式间歇或连续补加新鲜培养基，使菌体及其代谢产物的生产时间延 长的培养方式。补料方式可分为反馈补料和非反馈补料两类反馈补料包括pH-stat法、 DO-stat法、菌体浓度反馈法、呼吸商法等，非反馈补料可分为恒速流加培养、变速流加培养 和指数流加培养。由于硝化微生物在硝化过程中产生酸，而反硝化微生物进行反硝化作用时则产生 碱，而且硝化微生物和反硝化微生物的最适生长PH值亦不同，此外混合菌群对一定范围的 初始PH具有强大的自我调节功能。因此，必须将培养过程中的pH控制在合理范围才能实 现混合菌群的协调生长，共同维持较高的菌体生长速率和氨氮降解速率。高密度培养是一个相对概念，用以描述的单位是干细胞重/升(DCW/L)。广义来 说，凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可成为高密度培养。高密度培养有提 高菌体的发酵密度或单位体积培养液中菌体的浓度，进而提高体积产率；缩小生物反应器 体积，减少生产设备投资；强化下游分离提取，并减少废水量等优点。其综合效果达到提高 比生产率(单位体积、单位时间内产物的产量)，降低生产成本，加速产品的商品化进程，提 高产品在市场上的竞争力。高密度发酵过程中，营养控制是关键，发酵培养基中碳源、氮源和无机盐会造成溶 液渗透压过高，细胞脱水死亡，往往会抑制菌体的生长，使目的产物得率下降，而且过量的 碳源会使细胞迅速生长，导致溶解氧急剧下降。高密度培养通常采用补料培养，使各种培养 基成分低于抑制浓度。广义来讲，凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养， 一般认为其上限值为150 200g(DCW/L)，下限值为20 30g(DCW/L)。由于本发明中的硝酸菌与亚硝酸菌作为生长较缓慢的细菌，因此在48小时菌体干重能够达到20g/L已经可以 将其定义为高密度发酵。用于培养所述好氧脱氮微生物菌群的培养基可按本领域常规进行配置，比如参 照《混合脱氮微生物菌群的高密度培养》中的培养基组成，优选的，本发明所述培养基初 始浓度组成如下=NaHCO3L 0 5. Og/L,琥珀酸钠 0. 5 2. Og/L, (NH4)2SO4O. 5 2. Og/L, KH2PO4O. 01 0. 15g/L, K2HPO4O. 5 2. Og/L, NaCl 0. 1 1. Og/L, FeSO4O. 1 1. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 5g/L, MnSO4O. 01 0. 2g/L，溶剂为水，ρΗ7· 0 8. 5。更为优选的，所述培养基初始浓度组成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸钠0. 954g/L， (NH4)2SO4L 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L 0g/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L，溶剂为水，pH8. 0。优选的，所述培养在pH8. 0、30°C下进行，总培养时间为24 48h。所述好氧脱氮微生物菌群可为本领域常规菌群，比如硝化菌、反硝化菌、亚硝化菌 等，可从土壤或水中按常规方法筛选获得，也可采用市购复合菌粉。优选的，所述好氧脱氮 微生物菌群为硝化菌和亚硝化菌的混合，例如本发明申请人在在先申请CN201010107453. 6 中筛选获得的硝化菌CCTCC No =M 2010001和亚硝化菌CCTCC No =M 2010002的组合。硝化 菌和亚硝化菌的混合比例可不受限制，实际上，由于不同微生物菌群之间的相互影响和制 约，在污水处理系统中初始投入的硝化菌和亚硝化菌比值不确定的情况下，经过驯化培养， 最终处理系统中两种菌群会达到一定的平衡。优选的，硝化菌和亚硝化菌初始接种菌体比 例为0. 5 2 1。优选的，所述培养第5小时起开始连续流加开始连续流加葡萄糖、硫酸铵和琥珀 酸钠，维持培养基中葡萄糖浓度为20g/L、硫酸铵浓度为15g/L、琥珀酸钠浓度为2. 2g/L，于 30°C下进行好氧培养，总培养时间24h，即可获得所述混合脱氮微生物菌群。本发明的有益效果主要体现在本发明通过连续流加硫酸铵、琥珀酸钠，使得脱氮 菌群得率显著提高，脱氮菌群的细胞干重可达到20g/L及其以上；在保证菌体质量的前提 下，维持磷酸缓冲液PH为8，将菌群培养时间从48小时缩短为24小时，大大提高了效率。
图1为实施例1混合菌生长曲线图；图2为实施例2不同pH值下混合菌生长曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 培养基初始浓度组成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸钠0. 954g/L，(NH4) 2S041. 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L Og/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶剂 为水，ρΗ8· 0。上述培养基250mL/瓶接种市购硝化菌和反硝化菌复合菌粉IOg (沧州旺发生物技 术研究所生产，活菌总数> 80亿个/克)，一瓶在培养开始第10小时起流加葡萄糖、硫酸
5铵和琥珀酸钠，使培养基中维持葡萄糖浓度为20g/L、硫酸铵浓度为15g/L、琥珀酸钠浓度 为2. 2g/L，30°C、250r/min、通气量Ivvm空气条件下培养48h ；另一瓶培养过程中不添加任 何物质，在相同条件下培养，测得混合菌生长曲线如图1所示。由图1可知，混合菌群在未流加任何营养物质时，48h后仅能达到13g/L的菌体干 重，而连续补料维持2%葡萄糖、1.5%硫酸铵、0. 22%琥珀酸钠(培养过程中未控制pH值) 后，菌体浓度能在48h后达到20g/L。实施例2 培养基初始浓度组成如下:NaHC032. Og/L,琥珀酸钠0. 8g/L，(NH4)2SO4L 2g/L， KH2PO4O. 05g/L, K2HPO4L 2g/L, NaCl 0. 8g/L, FeSO4O. 5g/L, MgSO4O. lg/L, MnSO4O. 1/L,溶剂为 水，ρΗ7· 0 9· 0。上述不同pH值(ρΗ6. 0、ρΗ7. 0、ρΗ8. 0、ρΗ9. 0)的培养基250mL/瓶接种市购硝化 细菌、亚硝化细菌和反硝化细菌的混合菌液12g(河北益微生物技术有限公司，型号XH01)， 在培养开始第5小时起均流加葡萄糖、硫酸铵和琥珀酸钠，使培养基中维持葡萄糖浓度为 18g/L、硫酸铵浓度为16g/L、琥珀酸钠浓度为2. 5g/L，30°C、250r/min、通气量Ivvm空气条 件下培养24h，获得混合菌生长曲线见图2。由图2可知，pH为8时，菌体的净生长速率，在培养时间仅为24h时就能达到 18. 5g/L的效果。实施例3 培养基初始浓度组成如下=NaHCO3L 85g/L，琥珀酸钠0. 954g/L，(NH4) 2S041. Og/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L Og/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶剂 为水，ρΗ8· 0。上述培养基接种适量硝化菌CCTCC No =M 2010001和亚硝化菌CCTCC No =M 2010002，菌体初始比例为1 1，培养条件发酵过程控制温度30°C，搅拌转速为350r/ min,通气量为lvvm。结果参数菌群培养时间为24小时，细胞干重达到20. 7g/L。污泥驯化过程将上述发酵得到的微生物发酵液按照5% (ν/ν)(每IOOml的待处理污水中加入 5ml的微生物发酵混合液)的投加量加入生化池，维持7天，得到驯化后的活性污泥。实施例4 按照实施例3方案进行高密度发酵混合脱氮微生物培养后，制成生物脱氮剂该生物脱氮剂其工艺流程为
种子液培养-发酵罐培养-离心-稀释-喷淋-干燥 生物脱氮剂制作工艺流程首先将硝酸菌与亚硝酸菌混合接种于摇瓶中种子培养 基进行种子培养24小时获得种子液；种子液以10%体积比接种发酵培养基，培养第5小时 开始中流加葡萄糖、硫酸铵和和琥珀酸钠，使培养基中维持葡萄糖浓度为20g/L、硫酸铵浓 度为15g/L、琥珀酸钠浓度为2. 2g/L，在30°C、250r/min、通空气量Ivvm条件下培养24h。离 心收集菌体，然后将菌体稀释至固体制剂的最终含水量控制在8%左右，加入适量的脱脂乳作保护剂，均勻喷雾于麸皮载体上，自然密闭保藏或冷藏。该生物脱氮剂经第三方检测，得出结果如下表 实施例5 燕京啤酒(浙江仙都)有限公司，使用本发明高密度发酵混合脱氮微生物，能够 保持稳定达标。原水水质为BOD5 (五日生物耗氧量BiologyOxygen Demmand) 155mg/L, COD 310mg/L，总氮33mg/L，氨氮13mg/L各取1000ml，置于玻璃容器中，分别用该污水处理站污 泥与按实施例3方法驯化后的污泥进行好氧阶段处理，曝气量均为lvvm。反应18h后，原污 水站污泥处理的水样水质B0D515mg/L，COD 20mg/L,总氮16mg/L，氨氮5mg/L ；利用本发明 驯化污泥处理的水样水质为B0D550mg/L，COD 17mg/L,总氮4mg/L，氨氮2mg/L ；因此采用本 发明技术发酵的混合菌剂，总体效率可提高约50%。实施例6 绍兴污水处理发展有限公司，使用本专利技术高密度发酵混合脱氮微生物， COD (化学耗氧量，chemical oxygen demand) 400mg/L,总氮 30mg/L，氨氮 10mg/L 各取 1000ml，置于玻璃容器中，分别用该公司污水处理站污泥与按实施例3方法驯化后的污 泥进行好氧阶段处理，曝气量均为lvvm。反应18h后，原污水站污泥处理的水样水质 B0D520mg/L, COD 40mg/L,总氮20mg/L，氨氮6mg/L ；利用本专利驯化污泥处理的水样水质为 B0D56mg/L,C0D 20mg/L，总氮7mg/L，氨氮3mg/L ；因此采用本发明技术高密度发酵的混合菌 剂，总体效率可提高约50%。
权利要求
一种混合脱氮微生物菌群的高密度培养方法，所述培养为好氧脱氮微生物菌群的混合培养，其特征在于所述培养过程中维持pH为7.0～8.5，并在培养第5～10小时起开始连续流加葡萄糖、硫酸铵和琥珀酸钠，维持培养基中葡萄糖浓度为10～30g/L、硫酸铵浓度为5～25g/L、琥珀酸钠浓度为0.5～5g/L，于28～32℃下进行好氧培养获得混合脱氮微生物菌群。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养基初始浓度组成如下=NaHCO3L0 5. Og/L,琥珀酸钠 0. 5 2. Og/L, (NH4)2SO4O. 5 2. Og/L, KH2PO4O. 01 0. 15g/L, K2HPO4O. 5 2. Og/L, NaCl 0. 1 1. Og/L, FeSO4O. 1 1. 0g/L, MgSO4O. 05 0. 5g/L, MnSO4O. 01 0. 2g/L，溶剂为水，pH7. 0 8. 5。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养基初始浓度组成如下 NaHCO3L 85g/L,琥珀酸钠 0. 954g/L, (NH4)2SO4L 0g/L, KH2PO4O. 06g/L, K2HPO4L 0g/L, NaCl 0. 5g/L, FeSO4O. 4g/L, MgSO4O. 25g/L, MnSO4O. 08/L,溶剂为水，pH8. 0。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养在pH8.0、30°C下进行，总培养时间 为24 48h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述好氧脱氮微生物菌群为硝化菌和亚硝化 菌的混合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养第5小时起开始连续流加葡萄糖、硫 酸铵和琥珀酸钠，维持培养基中葡萄糖浓度为20g/L、硫酸铵浓度为15g/L、琥珀酸钠浓度 为2. 2g/L，于30°C下进行好氧培养，总培养时间24h，即可获得所述混合脱氮微生物菌群。
全文摘要
本发明提供了一种混合脱氮微生物菌群的高密度培养方法，所述培养为好氧脱氮微生物菌群的混合培养，本发明要点在于培养过程中维持pH为7.0～8.5，并在培养过程开始第5～10小时起连续流加葡萄糖、硫酸铵和琥珀酸钠，维持培养基中葡萄糖浓度为10～30g/L、硫酸铵浓度为5～25g/L、琥珀酸钠浓度为0.5～5g/L，于28～32℃下进行好氧培养获得混合脱氮微生物菌群。本发明通过连续流加硫酸铵、琥珀酸钠，使得脱氮菌群得率显著提高，脱氮菌群的细胞干重可达到20g/L及其以上；在保证菌体质量的前提下，维持磷酸缓冲液pH为8，将菌群培养时间从48小时缩短为24小时，大大提高了效率。
文档编号C12N1/00GK101921708SQ20101024494
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者丁青松, 何志明, 何欢, 周黎明, 堵国成, 郑展望, 陈坚 申请人:浙江商达水务有限公司