脂肪酸类化合物在促进反硝化微生物脱氮活性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于硝酸盐污染水体的控制技术研究领域，具体设及一种脂肪酸类化合物 在促进反硝化微生物脱氮活性中的应用。
【背景技术】
[0002] 2010年第一次全国污染源普查公报表明，农业源的硝酸盐污染已超过工业源成为 我国水体总氮污染的主要来源，引起了河流和湖泊水体富营养化，导致地表水污染和地下 水硝酸盐超标，严重威胁人体健康。从长远角度来看，过量的硝酸盐会导致整个生态群落结 构和多样性的变化。因此，农业废水和肥水的净化处理目前已成为水处理领域新的研究热 点。利用具有高效氮素吸收能力或能促进微生物除氮的水生植物来处理被硝酸盐污染的农 业废水，是一种有效的生物净化手段。
[0003] 浮萍是一种在农田和河网地区随处可见小型浮水植物。已有报道表明，浮萍对水 体氮素的加速去除主要是促进微生物的反硝化过程，而不是自身吸收能力强。植物根系能 通过分泌特定的化合物，来改变根际微生物的反硝化活性和群落结构，从而促进微生物除 氮。因此，强化植物-微生物的根际效应，如添加能刺激反硝化微生物脱氮的特定化合物， 将加速水体中氮素的转化去除，为构建高效处理农田排水氮的生物生态技术提供新的方法 和思路。
[0004] 在硝酸盐充足但有机物含量低的农田水体中，低的C/N比会使反硝化微生物的活 性受到限制。目前，大多数添加的能提高水体脱氮的含碳化合物，如糖类化合物（如葡萄 糖和果糖等），甲醇和乙酸等，主要作用是为反硝化微生物提供营养而促进微生物生长，若 使用不当，微生物的大量生长反而会引起水质恶化。而且，运些化合物在±壤和水体中容易 流失和被微生物分解，甲醇等还具有毒性。至今，植物源能加速微生物除氮的特定非营养性 的化合物鲜有报道，而运类"绿色"物质在植物-微生物根际信号传导过程起了更重要的作 用，能切实提高反硝化微生物的活性，在硝酸盐污染水体的控制技术领域具有更广阔的应 用前景。
【发明内容】
[0005] 解决的技术问题：本发明提供一种脂肪酸类化合物在促进反硝化微生物脱氮活 性中的应用。该物质能通过促进反硝化微生物的活性来提高水体氮素去除效率，强化植 物-微生物根际效应，W简单的方法解决水污染控制中处理低C/N农田排水时脱氮效率低 的技术难题，同时本发明的物质也能改善外加碳源易流失和被微生物分解的问题，提高反 硝化微生物对农田排水的脱氮效率，节约外加碳源的成本。
[0006] 技术方案：脂肪酸类化合物 在促进反硝化微生物脱氮活性中的应用。
[0008] 所述反硝化微生物为巧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)。
[0009] 所述脂肪酸类化合物提升巧光假单胞菌的反硝化活性。
[0010] 所述脂肪酸类化合物加速巧光假单胞菌对水体硝酸盐的去除。
[0011] 所述脂肪酸类化合物添加浓度为5-80mg ? L 1。
[0012] 提高巧光假单胞菌反硝化活性的组合物，有效成分为所述的脂肪酸类化合物。
[0013] 加速巧光假单胞菌对水体硝酸盐去除的组合物，有效成分为所述的脂肪酸类化合 物。
[0014] 有益效果：（1)本发明化合物能在低剂量下高效促进反硝化微生物的活性，避免 实际应用过程中因促进微生物大量生长而引起其他的水质恶化现象；
[0015] (2)本发明化合物是一种脂溶性化合物，在±壤和水体中不易流失，能保证应用的 稳定性和高效性。
[0016] (3)本发明提供一种"绿色"脱氮促进剂，可W解决常规有营养效应的碳源在净化 污水应用中效率低的问题，同时为构建高效处理农田排水氮的生物生态技术提供新的方法 和思路。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的浮萍提取物活性组分的GC/MS分析谱图。本发明促进剂亚油酸为 18. 62min出峰的物质；
[0018] 图2为本发明脱氮促进物质与其他脂肪酸促进率的比较（mean±SE，n=3),不同 的小写字母表示组间有显著差异（P<〇. 05, LSD test);
[0019]图3为本发明脱氮促进物质剂量-巧光假单胞菌脱氮效率促进率关系曲线 (mean±SE，n = 3)。
【具体实施方式】
[0020] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不W任何方式限制本 发明。
[0021] 本发明对太湖地区筛选到紫背浮萍（Spirodela polyrrhiza)的提取物进行提 取、分离和生物活性检测，并对活性组分进行GC/MS鉴定。在紫背浮萍提取物活性组分中 分离鉴定到5种脂肪酸类化合物，其中亚油酸Iinoleic acid (分子量：280. 45)，具有显著 的氮去除促进效果。所述的反硝化微生物为常见的巧光假单胞菌，该促进剂在添加浓度为 5-80mg?L1时，可对巧光假单胞菌脱氮率有约10-50%的促进效果。本发明的非营养性化 合物在微生物脱氮过程中主要起信号作用，促进了反硝化微生物的活性，而不是简单提供 碳源来促进反硝化微生物的生长。
[0022] 实施例1高效促进氮去除的脂肪酸类化合物与同类物质间的效果比较
[0023] I. I实验设计
[0024](1)标准品：5种脂肪酸类化合物，栋桐酸（Palmitic acid)，硬脂酸（Stearic acid),花生酸（Arachidic acid),山斋酸度 ehenic acid)和亚油酸（Xinoleic acid),均 购于 Sigma-Al化ich 公司（St. Louis, MO, USA)，并溶解于 CH2CI2中。
[00巧](2)微生物菌株：巧光假单胞菌（ACCC 01047)，购于中国农业微生物菌种保藏管 理中屯、。
[0026] (3)LB培养基：10g/L tryptone，5g/L yeast extract, lOg/L化Cl,pH7.0。
[0027] (4)反硝化培养基：0. 72g/L KNO3,1. Og/L 皿2口〇4,0. 20g/L M拆O4?7&0,2.8g/L 〔化胞2〇4? 6&0, pH 7. 0。 阳0測 妨生物活性实验
[0029]收集在LB培养液中活化20h的巧光假单胞菌，离屯、IOmin (5, OOOg, 4°C )，然后重 新悬浮于无菌的反硝化培养液中。ImL巧光假单胞菌菌液和20 y L各作用物质，添加到含有 19mL反硝化培养液的50mL =角瓶中，使得最终作用物质的浓度为20mg L 1，在摇床中30°C， 12化pm培养。对照为添加20 y L邸2化，实验设置3个重复。培养72h后，吸取1血菌液离 屯、IOmin (10, OOOg)，上清液测定总氮含量（碱性过硫酸钟消解紫外分光光度法）。菌液的 生物量用比浊法测定，即用分光光度计度io-Rad 3000;USA)测定菌体在600nm处吸光度。 巧光假单胞菌脱氮率（％)和促进率（％)的计算方法如下：
阳0巧 （6)数据分析
[0033] 数据处理结果均W (mean±S巧表示，采用SPSS18. 0统计软件进行单因素方差分 析及组间两两比较。
[0034] 1. 2实验结果 W35] 对浮萍提取物活性组分进行GC/MS分析，鉴定到5种脂肪酸类化合物，在 18. 62min (图1)出峰的物质为本发明促进剂亚油酸。通过5种脂肪酸类化合物的促进效果 反证实验，发现在浓度为20mg ? L 1时，同一类化合物的不同物质对巧光假单胞菌脱氮率有 不同的影响（表1)。在添加浓度20mg ? L 1本发明促进剂处理后，亚油酸对巧光假单胞菌 的脱氮率有最显著的促进作用（p<〇.05)，促进率约为27.4%(图2)。但其他4种作用物质 添加后对巧光假单胞菌的脱氮率无显著影响。而且，亚油酸的促进率与其他4种作用物质 有显著差异（图2)。结果表明，本发明的促进剂亚油酸对巧光假单胞菌的脱氮率有特定的 促进效果。
[0036] 相对于对照，运5种作用物质的添加对巧光假单胞菌的生长基本无影响，各处理 的ODe。。值在0.44-0. 47之间（表1)。可见，本发明的促进剂主要是提高了巧光假单胞菌的 反硝化活性。
[0037] 另外，由于添加20mg ? L 1亚油酸到反硝化培养液中，其总有机碳浓度（TOC)相对 于反硝化培养液中TOC占低于2%的含量，因此，本发明的促进剂亚油酸主要是起信号作用 激活反硝化活性，而不是简单提供反硝化微生物的碳源来促进其生长。
[0038]表1
[0039]
[0040] *不同的小写字母表示组间有显著差异（P<0. 05, LSD test)
[0041] 实施例2促进剂亚油酸对巧光假单胞菌脱氮效率的促进作用
[0042] 2. 1实验设计
[0043] 分别添加5,10, 20, 40, 60, SOmg'L1的本发明促进剂亚油酸于反硝化培养液中，再 添加1血巧光假单胞菌菌液，于摇床中30°C，120巧m培养，对照为邸2〇2。培养7化后，菌 液按照1. 1中方法离屯、，上清液测定总氮浓度，计算各处理后的脱氮促进率（％)。
[0044] 2. 2实验结果
[0045] 本发明促进剂在添加浓度为5-80mg ? L 1时，对巧光假单胞菌的脱氮率有约 10-50%的促进效果（图3)。由于在添加60mg . L 1浓度时，脱氮促进率为47. 4%，已基本 达到最高值，所W考虑到成本，建议在应用过程中亚油酸的添加量为60mg 'L 1左右，同时为 应用于其他反硝化菌株的剂量作参考。
【主权项】
1. 脂肪酸类化合物在促进反硝化微生物脱氮活性中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述反硝化微生物为荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescens)〇3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述脂肪酸类化合物提升荧光假单胞菌的 反硝化活性。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述脂肪酸类化合物加速荧光假单胞菌对 水体硝酸盐的去除。5. 根据权利要求1~4任一所述的应用，其特征在于所述脂肪酸类化合物添加浓度为 5-80mg·L:〇6. 提高荧光假单胞菌反硝化活性的组合物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的 脂肪酸类化合物。7. 加速荧光假单胞菌对水体硝酸盐去除的组合物，其特征在于有效成分为权利要求1 所述的脂肪酸类化合物。
【专利摘要】脂肪酸类化合物在促进反硝化微生物脱氮活性中的应用，结构式为的化合物在促进反硝化微生物脱氮活性中的应用。本发明提供的化合物是从水生植物浮萍提取物中分离，具有良好的氮素去除促进活性，可在低剂量下有效提高常见反硝化细菌荧光假单胞菌的脱氮效率，在农业环境保护上可用作硝酸盐污染水体的净化增效剂。
【IPC分类】C02F3/28, C02F3/34
【公开号】CN105293691
【申请号】CN201510767280
【发明人】陆玉芳, 施卫明, 孙力
【申请人】中国科学院南京土壤研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月11日