对水产养殖环境沉积物中反硝化微生物的定量方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种对水产养殖环境沉积物中的反硝化微生物进行实时荧光定量PCR 检测的方法，属于环境微生物生态学技术领域，该技术用于测定水产养殖沉积物中反硝化 微生物的数量。 技术背景：
[0002] 我国是世界第一的水产养殖大国和水产品贸易大国，2012年水产品总量就达到了 5907. 68万吨，约占全球总量的38%，连续24年位居世界首位。为了提高单位产量，养殖 过程中往往过量投入肥料、饵料等，导致养殖环境中残饵、动物排泄物及尸体不断堆积，碳、 氮、磷的含量超标，富营养化程度严重，养殖生物频繁发生病害或死亡。这不但降低了养殖 业的产量和质量，还污染了养殖环境，并随着养殖环境废水的排放影响到周边环境。对养殖 生物和环境的危害最大的物质是含氮化合物，如氨氮、亚硝酸根、硝酸根等，有效去除含氮 污染物是保证水产养殖业可持续发展的前提。
[0003] 在氮素循环中，消除氮污染、降低富营养化主要依赖反硝化过程。反硝化过程大 致可分为四步：N0 3 - N0 2 - N0 - NO 2- N 2，这四步都由反硝化微生物进行。反硝化微生 物是一类能够把硝态氮（N03-N)转化为气态氮（N 2)的微生物群落，地理分布比较广泛，在 土壤、海洋、河口、湖泊等自然环境和废水处理厂、堆肥、生物反应器等人工环境中都有发 现。在系统发育上，具有很高的多样性，分属于假单胞菌属（P seudomonaceae)、芽孢杆菌属 (Bacillu s)、产碱杆菌属（Alcaligene s)等多个属；在营养方式上，分为异养型和自养型， 大部分属于异养型，有一些只利用一种碳源，还有一些能够利用氢气（H2)、二氧化碳（C0 2) 或其他物质进行自养生长；在需氧情况上，分为好氧型和厌氧型，之前一直认为反硝化微生 物参与反硝化作用需要在厌氧的条件下，随着研究的进一步开展，好氧反硝化微生物也不 断被发现。现阶段对反硝化微生物的数量测定技术水平有限，传统的富集培养方法仅能得 到环境中小于1 %的微生物，无法用于对反硝化微生物的研究和定量。分子生态学上常用的 16S rRNA基因，由于反硝化微生物系统发育广泛的多样性，也无法设计特异性引物，用来研 究和检测其群落组成、分布和数量。
[0004] 在反硝化过程的四个步骤中，由亚硝酸盐（N02)转化为一氧化氮（N0)的过程，是 反硝化作用有别于其它硝酸盐代谢的标志性反应，是反硝化过程中最重要的限速步骤，亚 硝酸盐还原型反硝化微生物也被作为代表性种类，被广泛用于反硝化微生物种群组成和数 量的研究。亚硝酸盐还原酶（Nir)是催化此反应的限速酶，可作为分子标记对反硝化微生 物进行定量研究。亚硝酸盐还原酶存在于细胞周质中，有两种类型，一种是可溶性含铜酶 (Cu-Nir)，含有Cu催化中心，称为Cu型亚硝酸盐还原酶，由nirK基因编码；另一种是细胞 色素还原酶（cdl-Nir)，含有细胞色素c和dl，称为Cyt cdl型亚硝酸盐还原酶，由nirS基 因编码。两种酶功能相同，但结构和催化位点不同，而且不能共存于同种细胞中。在同一环 境中，含有两种Nir酶的微生物同时存在。
[0005] 现有的研究和报道多集中于对nirS基因的研究，也有少量对nirK基因的报道。 在李敬源等[1]对典型对虾水体中参与硝化与反硝化过程的微生物群落结构的研究中，使 用PCR-DGGE的方法，对虾塘的8个站位构建nirS基因文库，并通过RFLP对克隆文库进行 酶切分析；研究结果显示，典型虾塘养殖水体中nirS基因文库群落结构比较复杂，多样性 丰富。在宋亚娜等 [2]对稻田土壤nirS型反硝化细菌群落对氮肥水平响应的研究中，使用 PCR-DGGE结合DNA克隆测序和荧光定量PCR技术对反硝化细菌nirS基因进行检测，分析 田间定位试验第4年不同氮肥水平下，稻田nirS型反硝化细菌群落结构和丰度的变化；结 果表明，稻田表层土壤的nirS型反硝化细菌群落对氮肥水平提高的响应程度更为明显。在 程占冰等 [3]对淡水富营养型湖泊沉积物nirS基因的多样性和系统发育的研究中，构建了 nirS基因文库，并使用RFLP技术对基因文库进行分析，测定序列并构建系统发育树；结果 显示，武汉东湖淡水富营养型湖泊沉积物中nirS基因多样性较为丰富，且TN、NH 4+和N03的 浓度可能是影响nirS类反硝化微生物多样性和空间分布的重要因素之一。在曾希柏等 [4] 对设施菜地nirK型反硝化细菌群落结构和丰度受施肥影响的研究中，使用T-RFLP和实时 荧光定量PCR的方法，对不同施肥条件不同土层下nirK型反硝化细菌群落结构和丰度的变 化进行研究；结果表明，施肥对土壤中nirK型反硝化细菌的群落结构具有明显的影响，土 壤pH值、有机质及硝酸盐含量均影响nirK型反硝化细菌的群落结构和丰度。但是，单独对 某一种类型Nir基因的检测必然会损失另一种类型微生物的信息，不能全面反映反硝化微 生物的种群组成和数量。只有同时检测nirK和nirS基因的数量，才能得到反硝化微生物 全面而准确的数量信息。
[0006] 本发明使用实时荧光定量PCR(qPCR)的方法检测养殖环境中的反硝化微生物。 qPCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过检测整个过程中荧光信号的累积来实时 监测PCR过程。qPCR技术具有操作简单、自动化程度高、全封闭不易污染、特异性强、重复 性好、灵敏度高、通用性好等优点。使用实时荧光定量PCR的方法对反硝化微生物功能基因 nirK和nirS进行定量研究，能够快速、灵敏、准确的对水产养殖环境中两种不同类型反硝 化微生物的数量进行检测，全面分析养殖环境中反硝化微生物的数量，对解决水产养殖环 境氮素污染及富营养化问题具有重大意义。
[0007] 参考文献
[0008] [1]李敬源，林炜铁，罗剑飞，田国梁.典型对虾养殖水体中参与硝化与反硝化过 程的微生物群落结构.微生物学报，2012, 52(4) :478-488.
[0009] [2]宋亚娜，吴明基，林艳.稻田土壤nirS型反硝化细菌群落对氮肥水平的响 应?中国农业科学，2013,46(9) :1818-1826.
[0010] [3]程占冰，杨江科，李鹤，朱兵，陈相军，闫云君.淡水富营养型湖泊沉积物亚硝 酸还原酶基因（nirS)的多样性和系统发育.微生物学报，2011，51 (5) :667-675.
[0011] [4]曾希柏，王亚男，王玉忠，白玲玉，李莲芳，段然，苏世鸣，吴翠霞.施肥对设施 菜地nirK型反硝化细菌群落结构和丰度的影响.应用生态学报2014, 25(2) :505-514.
【发明内容】
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[0012] 本发明的目的在于提供一种实时荧光定量PCR检测反硝化微生物的方法。使用实 时荧光定量PCR技术，对反硝化微生物编码亚硝酸盐还原酶的功能基因nirK和nirS进行 定量研究，从而实现对水产养殖环境中反硝化微生物快速、灵敏、准确的定量研究。实现本 发明的过程主要包括以下步骤：
[0013] 1、宏基因组DNA的提取
[0014] 沉积物样品宏基因组DNA使用土壤DNA快速提取试剂盒，在核酸提取仪上提取，操 作方法如下：称取0. 3g样品，加入到裂解反应管中，向管中加入1100 y 1裂解缓冲液。裂解 反应管放入核酸提取仪中，设定速度4. 5,时间30s，进行裂解。结束后在4°C，13000rpm离心 15min，上清移入新的离心管，加250 y 1蛋白沉淀缓冲液，混勾；4°C，13000rpm离心5min，上 清移入新的离心管中，加入1000 y 1已经摇匀的悬浮液，颠倒混匀2min，放于管架上4°C静 置3min。吸出600 y 1上清丢弃，混匀后液移入纯化柱中，4°C，llOOOrpm离心lmin，倒掉废 液。向纯化柱中加500 y 1加入无水乙醇的洗涤缓冲液，4°C，llOOOrpm离心lmin，倒掉废液， 重复三次，4°C，llOOOrpm离心2min。将纯化柱放入新的1. 5ml离心管中，室温干燥5min。 纯化柱加入溶解缓冲液，55°C水浴6min，4°C，llOOOrpm离心lmin，即得到待测样品的宏基 因组DNA。使用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测，存于-80°C备用。
[0015] 2、特异性引物的确定
[0016] 目前，针对nirK和nirS基因设计的特异性引物有很多，如nirK基因特异性引 物：FlaCu/R3Cu、FlaCu/nirK3R、FlaCu/nirK5R、nirKlF/R3Cu、nirKlF/nirK3R、nirKlF/ nirK5R 等；nirS 基因特异性引物：cd3aF/R3cd、cd3aF/R4cd、cd3aF/nirS4R、cd3aF/nirS6R、 nirSlF/R3cd、nirSlF/nirS6R、nirSlF/nirS4R、nirS3F/nirS6R 等，这些引物分别匹配基因 的不同保守位点，并且扩增出来的基因片段大小不同。在选择引物时，考虑到所研究的水产 养殖环境中硝酸根、亚硝酸根等含量偏高的特点，并且已报道的反硝化微生物绝大部分属 于变形细菌、假单胞菌、产碱杆菌、微球菌等菌属。我们经过试验后，最终确定了扩增nirK 基因的引物为FlaCu/R3Cu，扩增nirS基因的引物为cd3aF/R3cd。
[0017] 3、标准质粒的构建
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