鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及 多重荧光PCR检测方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，国内外广大消费者对化妆品的产品质量和成效品种等都提出了更高的要 求。尤其是传统的护肤、护发和清洁用的化妆品，在性能上已不能满足消费则的要求。化妆 品的生产正朝着具有营养和疗效的方向发展。尤其以动物性成分及其提取物作为特殊成分 应用于化妆品的研究颇为活跃，用途也在不断扩大。其中驴奶、马奶是理想的化妆品原料， 驴奶、马奶的营养价值是科学界共识，《本草纲目》就曾对此有明确介绍。它们含有丰富的 维生素和人体所需要的脂肪酸，还有抗衰老、抗氧化及有助细胞再生的有效成分。驴奶中富 含丰富的"美白因子"，有明显的美白肌肤，保湿平皱的作用；此外，驴奶中含有足量的脂肪， 如w-3系列的脂肪酸和《-6系列的脂肪酸，它们有助于维生素的吸收。因为这些丰富的 营养价值，目前已被广泛应用到美容产品上。传说埃及艳后就是每天洗驴奶浴保持着皮肤 白嫩润滑。马油，即马的脂肪，源自于中国古代的中医药方。马油有祛痘印、疤痕、祛斑以及 细腻肌肤等功效，尤其是在冬天对手脚冻伤有特效。
[0003] 鉴于驴奶、马奶较高的营养价值和药用价值，近年来驴奶、马奶制品的价格远高于 普通牛奶制品，其市场需求量更是逐年上升，但由于内地人食肉和熬皮制胶等需要，驴存栏 量却逐年降低，使得驴奶成为稀有物种资源。在市场利益的驱动下，一些没有驴奶资源的化 妆品生产企业也纷纷推出了驴奶面膜、马油膏、驴奶面霜等产品，一时间市场上真假驴奶马 奶难辨。有些企业在化妆品种中掺入牛奶，冒充驴奶，有些号称含驴奶成分的化妆品甚至 没有添加任何驴、马源性成分严重侵害了消费者的利益。目前我国对化妆品行业动物源性 检测环节技术薄弱，与国际水平还有一段明显的距离，我国化妆品行业想得到健康的发展， 就迫切需要解决主要成分真伪鉴定问题，需要对大量的化妆品进行实时快速的动物源性测 定，因此开发一种快速有效的检测试剂盒势在必行。
[0004] 虽然目前国际国内对食品、饲料中动物源性检测方法报道很多，但多是形态学观 察，不适用于化妆品中通过深加工的动物产品；免疫学检测方法（ELSIA)是一种基于可溶 性抗原与抗体反应的简便方法，目前已开发研制了几种商业化的检测生肉及中度加工的 食品中动物成分的检测试剂盒，但如果经过高温灭菌处理后的产品则不能检出；近红外线 光谱检测方法（NIRS)在食品饲料中广泛地用于饲料的质量控制分析，如水分、蛋白、脂肪、 灰分、糖、淀粉、纤维等的测定，该方法检测快捷，使用中没有有害物质，样品用量少，但该方 法的最大缺点是非直接的，因此需要大量的具有权威性的标准品样品以形成标准或判别模 式，即针对不同动物成分、不同组份所建立的光谱库，其结果不能单独作为法律依据。而以 聚合酶链式反应（PCR)为基础的技术已逐步成为了食品中动物源性成分种属鉴定的核心 方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度， 尤其适合于各种深加工产品，并使得成分含量的定量溯源成为可能。目前对化妆品中驴、马 及牛源性成分多重荧光PCR检测研究还尚未报道，因此，建立一种快速鉴定化妆品中驴、马 及牛源性成分多重荧光PCR检测方法及检测试剂盒对化妆品的安全快速监管具有重要的 创新性实践意义。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明提供了一种快速鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的 引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光PCR检测方法。该发明的引物、探针组合物以及试剂 盒特异性强，灵敏度高，检测结果准确可靠，并能有效指示假阴性出现；该发明的多重荧光 PCR检测方法无须开盖、不易污染，灵敏准确，通量大，对化妆品的安全快速监管具有重要的 创新性实践意义。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物，包括以下引物和探针，其 核苷酸序列如下：
[0008] (1)引物
[0009] 通用引物：上游引物：5' AGACGAGAAGACCCTATGGAG 3' ；
[0010] 下游引物：5'CTCCGAGGTCACCCCAA 3' ；
[0011] ⑵探针：
[0012] 驴特异探针（LP) :5' CACAAAAAATAATATACAAACCTAACCTCCAG 3' ；
[0013] 马特异探针（MP) :5' CAACACACAAACCTAACCTTCAGGGA 3' ；
[0014] 牛特异探针（NP) :5' CCAACCCAAAGAGAATAAATTTAACCATTA 3' ；
[0015] 内标探针（16sP) :5'AAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTC 3' ；
[0016] 本发明的引物及探针设计方法为：从NCBI数据库中分别下载马、驴和牛3种动物 的线粒体16S rRNA基因序列各10条，应用同源分析工具Mega5.0软件进行同源性比对，设 计原则是，种间序列差异较大的区域及种内保守区域设计特异引物及探针，利用设计软件 Primer 5. 0根据筛选出的核心片段两端相似序列设计一对通用引物，使用Primer3. 0设计 TaqMan特异探针，在NCBI数据库中BLAST探针和引物的特异性，采用5种发光基团为FAM， JOE，CY3, CY5, R0X中的任意4种不同发光基团分别对各个探针的5'端进行荧光修饰，所有 探针的3'端修饰有淬灭基团，可以为TAMRA、BHQ1或BHQ2中的一种或两种。
[0017] 进一步的，上述鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物，驴特异探 针（LP)用FAM标记，马特异探针（MP)用CY3标记，牛特异探针（NP)用J0E标记，内参探针 (16sP)用R0X标记；所有探针的3'端的淬灭基团用BHQ1修饰。
[0018] -种鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒，包括上述引物、探针组合物，以 及PCR反应所必需的反应原料和试剂。
[0019] 上述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒，还包括内标，内标核苷酸序列 如下：
[0020] 5 ' -AGACGAGAAGACCCTATGGAGTACAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGC TCCAITGGTGACCTCAITITTTAGGITTGGGGTGACCTCGGAG-3'（如 SEQ ID N0. 7 所示）。
[0021] 本发明设计和构建阳性扩增内标DNA重组质粒和TaqMan特异性内标探针的方法 为：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，在NCBI中BLAST与之同源的DNA片段，在 这段随机DNA序列上下游分别连接上驴、马和牛3种动物源性的通用引物序列，从而形成 109bp的阳性扩增内标DNA序列，将这段扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接到 PMD18-T载体上，转化感受态DH5a，质粒提取，经DNA测序验证与目的片段一致，以内标序列 为模板使用Primer3. 0设计TaqMan特异性内标探针。
[0022] 具体的，上述试剂盒包括：2XTaqman Master Mix，Taq酶，超纯水，驴、马和牛通用 引物混合物，驴、马和牛对应的TaqMan特异探针混合物，以及人工构建的内标质粒及内标 探针混合物。
[0023] PCR反应所必需的反应原料和试剂包括：PCR缓冲液，MgCL2、dNTPs，Taq酶和超纯 水；
[0024] 进一步的，上述试剂盒中优选2〇111的反应体系：2\1391]^111&18七611^1&11值为 8. 9,镁离子浓度为2. 5mM，4种dNTP的终浓度各为250 y M)，Taq酶的用量为1U，各引物、探 针的终浓度均为0. 4-1 y M，及lpg/ y L的内标DNA。
[0025] 20yL反应体系如下：
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[0027] 进一步的，上述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物在检测鉴 定化妆品中驴、马及牛源性成分中的应用。
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