一套金银花种质鉴定引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物品种鉴定领域，涉及一套金银花种质鉴定引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 简单重复序列（simple sequence repeat，SSR)或者微卫星序列（Microsatelite， MS)是指基于真核生物基因组DNA中存在简单重复序列且重复序列的数目变化很大而产生 的，重复序列的侧翼为十分保守的单拷贝序列，因此SSR具有很强的多态性。SSR标记相比 于其他分子标记的优势在于具有共显性标记（鉴别杂合子、纯合子）且重复性好的特点。劣 势在于其引物设计必须依赖于简单重复序列。SSR分子标记目前已应用于种质资源亲缘关 系、遗传连锁图谱构建和遗传多样性等研究。
[0003] 目前，SSR标记已在药用植物育种、指纹数据库的构建、品种鉴定及种子纯度方面 得到了广泛的应用。Szewc-McFadden等利用SSR序列筛选甘蓝型油菜基因组文库，获得的 17对SSR引物皆能在芸薹（AA)、甘蓝（CC)及甘蓝型油菜（AACC)材料中扩增出产物，其中 13对SSR引物的扩增产物具有多态性。Marion等利用该技术从含有A、B、D 3个染色体组 的六倍体小麦基因组中开发出230对SSR引物，其中大多数引物都是基因组特异性的，小麦 主要有 AG-SSR、CA-SSR、TA-SSR、TC-SSR、GT-SSR。Kresovieh 等通过构建油菜含 15000 份 克隆的小片段基因组文库，获得了丰富的油菜SSR标记，发现其中GA重复单位的数量是CA 和GATA的4-5倍。Uzunova等在筛选白菜基因组文库SSR序列时，发现每100kb就有1个 GA/TC重复序列，而CA/TG的丰度只是GA/TC的1/4。因此，SSR标记具有丰富的多态性，可 有效的分析栽培金银花种质资源的遗传多样性。
[0004] DNA指纹图谱（DNA finger print)是以DNA标记为基础的，能将品种之间彼此区 分开的电泳图谱，构建的指纹图谱在不同种质间具有特异性，能够快速的、准确的鉴别品种 或品系，为良种选育和品种纯度鉴定提供便利。目前，SSR标记指纹图谱的构建在遗传多样 性分析、比较基因组研究等方面有广泛的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定金银花种质的成套引物对 组。
[0006] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定金银花种质的成套引物对组，具体由如下7 个引物对组成：由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1 ;由序 列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2 ;由序列表中序列5和序 列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3 ;由序列表中序列7和序列8所示的两条单 链DNA分子组成的引物对4 ;由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA分子组成的 引物对5 ;由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA分子组成的引物对6 ;由序列 表中序列13和序列14所示的两条单链DNA分子组成的引物对7。
[0007] 其中，所述引物对组中的各引物对分别单独包装。组成各引物对的两条单链DNA 分子既可以分别单独包装，也可以以摩尔比为1:1的比例混合包装（4°C以下保存）。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定金银花种质的成套PCR试 剂。
[0009] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定金银花种质的成套PCR试剂，具体由如下7 种PCR试剂组成：由所述引物对组中的引物对1、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和水组 成的PCR试剂1 ;由所述引物对组中的引物对2、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和水组 成的PCR试剂2 ;由所述引物对组中的引物对3、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和水组 成的PCR试剂3 ;由所述引物对组中的引物对4、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和水组 成的PCR试剂4 ;由所述引物对组中的引物对5、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和水组 成的PCR试剂5 ;由所述引物对组中的引物对6、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和水组 成的PCR试剂6 ;由所述引物对组中的引物对7、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和水组 成的PCR试剂7。
[0010] 其中，所述成套PCR试剂中的各PCR试剂分别单独包装。各PCR试剂的组分既可以 分别单独包装，也可以是组成如下的混合液：每24 y L PCR试剂中含有19. 8 y L水，2. 5 y L 10父？0?扩增缓冲液（含15111111〇1/1]\%(：12)，11^2.5111111〇1/1(1犯1 38，1(^111〇1/1上下游引物 各 0? 25 y L，2. 5U DNA 聚合酶 0? 2 y L。
[0011] 本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定金银花种质的试剂盒。
[0012] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定金银花种质的试剂盒，含有所述的引物对组 或所述成套试剂。
[0013] 以上所述金银花种质均可选自如下53个金银花种质中的任一种：河北红银花、河 北九丰一号、河北小鸡爪花、河北小线花、河北叶里齐、河北山花子、河北一线红、河北大麻 花、河北大毛花、河北四季花、河北大站花、河北大线花、河北大鸡爪花、河北金丰一号、河北 巨花一号、河南野生1、河南大毛花、河南野生大毛花、河南野生2、河南小毛花、河南线花、 江苏亚特、江苏大毛花、江苏九丰一号、江苏鸡爪花、江苏-河南引种、江苏红、江苏巨花一 号、江苏四季花、山东大毛花、山东四季花、山东鸡爪花、山东红金、山东中花一号、山东野生 3、山东亚特红蕾、山东亚特立本、山东亚特青蕾、山东亚特良种、山东-美国引种、山东-意 大利引种、广西-山东引种、云南亚特、湖南九丰一号、重庆-山东引种、湖北-河北引种、安 徽-山西引种、陕西金花3号、河南尖山大毛花、河南封丘大毛花、宁夏-山东引种、甘肃亚 特、北京亚特立本。
[0014] 制备所述引物对组的方法和制备所述成套PCR试剂的方法也均属于本发明的保 护范围。
[0015] 其中，制备所述引物对组的方法具体可包括将所述引物对组中的所述7个引物对 分别单独包装的步骤。制备所述成套PCR试剂的方法具体可包括将所述成套PCR试剂中的 所述7种PCR试剂分别单独包装的步骤。
[0016] 所述引物对组或所述成套PCR试剂或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定金银花种质 中的应用也属于本发明的保护范围；所述金银花种质为以上所述53个金银花种质中任一 种。
[0017] 本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测金银花是否属于所述53个 金银花种质中的任一种的方法。
[0018] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测金银花是否属于所述53个金银花种质中的 任一种的方法，具体可包括：
[0019] (1)以所述53个金银花种质的基因组DNA为模板，采用所述引物对组或所述成套 PCR试剂或所述试剂盒中的7个引物对分别进行PCR扩增、电泳检测扩增产物，所述53个金 银花种质中的每个种质均获得对应于所述7个引物对的7种含有特异性条带的电泳图谱；
[0020] 以待测金银花的基因组DNA为模板，采用所述引物对组或所述成套PCR试剂或所 述试剂盒中的7个引物对分别进行PCR扩增、电泳检测扩增产物，得到对应于所述7个引物 对的所述待测金银花的7种电泳图谱；
[0021] 同一引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱与所述53个金银花种质的电 泳图谱相对应；
[0022] (2)将所述7个引物对中每个引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱与所 述53个金银花种质的对应电泳图谱分别进行比对，根据比对结果按照如下确定所述待测 金银花是否属于所述53个金银花种质：
[0023] 若所述7个引物对中全部引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱的条带 均与所述53个金银花种质中的某一金银花种质的对应电泳图谱中的特异性条带一致，则 所述待测金银花属于或候选属于该金银花种质；
[0024] 若所述7个引物对中至少一个引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱的 条带与所述53个金银花种质中的某一金银花种质的对应电泳图谱中的特异性条带不一 致，则所述待测金银花不属于或候选不属于该金银花种质。
[0025] 本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测金银花是否与对照金银花 属于同一种质的方法。
[0026] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测金银花是否与对照金银花属于同一种质的 方法，具体可包括：
[0027] (1)以对照金银花的基因组DNA为模板，采用所述引物对组或所述成套PCR试剂或 所述试剂盒中的7个引物对分别进行PCR扩增、电泳检测扩增产物，得到对应于所述7个引 物对的所述对照金银花的7种电泳图谱；
[0028] 以待测金银花的基因组DNA为模板，采用所述引物对组或所述成套PCR试剂或所 述试剂盒中的7个引物对分别进行PCR扩增、电泳检测扩增产物，得到对应于所述7个引物 对的所述待测金银花的7种电泳图谱；
[0029] 同一引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱与所述对照金银花的电泳图 谱相对应；
[0030] (2)将所述7个引物对中每个引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱与所 述对照金银花的对应电泳图谱分别进行比对，根据比对结果按照如下确定所述待测金银花 与所述对照金银花是否为同一种质：
[0031] 若所述7个引物对中全部引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱的条带 均与所述对照金银花的对应电泳图谱中的特异性条带一致，则所述待测金银花与所述对照 金银花为或候选为同一种质；
[0032] 若所述7个引物对中至少一个引物对扩增得到的所述待测金银花的电泳图谱的 条带与所述对照金银花的对应电泳图谱中的特异性条带不一致，则所述待测金银花与所述 对照金银花不为或候选不为同一种质；
[0033] 所述对照金银花具体可为以上所述53个金银花种质中任一种。
[0034] 在以上各方法中，采用所述7个引物对扩增得到的所述53个金银花种质的电泳图 谱中的特异性条带如表3所示。
[0035] 在以上各方法中，所述PCR扩增时采用的退火温度具体可为46-51 °C。所述7个引 物对中每个引物对的PCR扩增时采用的退火温度具体参见表2。
[0036] 进一步，所述PCR扩增的反应条件具体为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，46~ 51°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,35个循环；72°(：延伸7111111。
[0037] 进一步，所述PCR扩增的反应体系具体为：19. 8 y L ddH20,2. 5 y L 10XPCR扩增缓 冲液，lyL 2.5mmol/L dNTPs，10ymol/L 上下游引物各 0.25yL，2.5U rTaq酶（宝生物工 程（大连）有限公司）〇? 2 y L，1 y L DNA模板。
[0038] 在前述四种方法中，所述电泳具体可为聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述聚丙烯酰胺凝 胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度可为8% (质量百分含量）。在本发明中，所述聚丙 烯酰胺凝胶电泳具体为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0039] 实验证明，本发明筛选出7对核心SSR引物，这些引物的组合，可以准确的将53个 金银花种质区分开来，由这些引物组成的指纹图谱，能更加真实地反映试验品种的真实遗 传身份，避免因盲目引种导致的种质混乱。
【附图说明】
[0040] 图1为引物SSR9118060和SSR9412929的部分供试金银花种质的扩增带型。其中， A为引物SSR9118060的扩增结果；B为引物SSR9412929的扩增结果。图中，M为Marker(DL 500DNA Marker)，2~46为种质编号（与表1中的编号相对应）。
【具体实施方式】
[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 下述实施例中涉及的53个金银花种质（表1)记载于"张山山，袁媛，黄璐琦 等.栽培金银花非腺毛性状特征研究.中国中药杂志，2015年第40卷第3期"和"张山 山，黄璐琦，袁媛等.栽培金银花农艺性状的数量分类学研究.中国中药杂志，2014年第 39卷第8期"中。公众可以从申请人处获得用于重复本发明相关实验。
[0044] 金银花种质材料"河南牛店大毛花"记载于"张山山，袁媛，黄璐琦等.栽培金银 花非腺毛性状特征研究.中国中药杂志，2015年第40卷第3期"中。公众可以从申请人处 获得用于重复本发明相关实验。
[0045] 表1金银花53份种质材料
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[0048]
[0049] 实施例1、用于鉴定金银花种质的SSR引物的筛选
[0050] 本发明对金银花品种大毛花和鸡爪花的花蕾材料进行了基因组测序，去除冗余并 经过拼接，分别获得4792546和3177510条contig序列，拼接长度分别为417594598bp和 248899172bp。利用生物信息学方法筛选SSR标记。通过ssr. pi程序（http://www. gramene. org/db/markers/ssrtool)搜索已获得的大毛花和鸡爪花基因组序列，识别标准为：二、 三、四、五、六核苷酸重复基序的重复次数分别为10、9、8、7、6、5、4、3次。然后通过131 &^~筛 选大毛花和鸡爪花的基因组序列，共获得13083对同源序列对，其中具有差异的SSR为1697 对，从中筛选出分布平均的22对引物用于PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，SSR引物信息 见表2。
[0051] 表2 22对SSR引物信息
[0052]
[0053]
[0054]
[0055] 注：表2中的扩增产物是指引物设计时上下游引物所扩增的序列片段，来源于固 定的一条具有合适SSR的contig序列，是所有忍冬都能扩增出来的那段序列，也是最主要 的扩增数量最多的序列，而不同的金银花种质在这段序列上存在重复基序或者重复次数的 变异，因而可以扩增出不同片段长度的条带，这也是SSR多态性的主要来源。
[0056] 用所选取的22对SSR引物（表2)在53个金银花栽培种质（表1)上进行PCR扩 增，均可得到有效的PCR产物，从中筛选出多态性较强、扩增带型稳定、重复性较好的7对核 心 SSR 引物（SSR9008219, SSR9118060, SSR9122370, SSR9308616, SSR9412929, SSR9553121， SSR9562432)，占所用引物的31. 8%，共检测到68个等位基因扩增出来的片段，片段大小为 100~700bp之间。
[0057] 实施例2、用于鉴定金银花种质的SSR引物的应用
[0058] 供试金银花种质材料为表1中所示的58份种质材料。
[0059] 一、总 DNA 提取
[0060] 用改良CTAB法提取总DNA，具体操作步骤如下：将2XCTAB提取液放在65°C水浴 锅里预热，取适量的供试金银花样品（干燥的花蕾或叶片）（约0. lg)，装入2mL离心管中， 每个管都加入一颗经无水乙醇点燃灼热灭菌的钢珠，用混合型球磨机打磨1分钟；将钢珠 倒出，每管加入900 y L预热的2 X CTAB提取液，用振荡器将样品摇匀，加入10 y L巯基乙醇 (通风橱内加入）和少量PVP，混勾，置于65°C水浴锅中温浴1. 5小时，每隔20min翻匀两 次；停止水浴，取出材料，室温下冷却，加入900 y L氯仿-异戊醇（体积比24:1)溶液，温和 摇勾5~lOmin，使之成乳池液，用离心机离心10min(12000转/分钟）；将上清液750 yL 左右转移到新的2mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1)溶液，用力摇匀 5min，使之充分混匀，离心10min(12000转/分钟）；将上清液500 y L左右转移到新的1. 5mL 离心管中，加入330 y L异丙醇（约占上清液的2/3)，混匀，-20°C冰箱里静置30min ;4°C冷 冻离心机中离心10min(12000转/分钟），弃上清，用500 yL 70%乙醇洗两次，每次离心 5min (12000转/分钟），再用无水乙醇洗两次，每次离心5min (12000转/分钟），最后用吸 水纸吸干，放在37°C烘箱中烘20~30分钟，使乙醇挥发彻底，加入适量灭菌蒸馏水（50~ 100 y L)，使之溶解，测量0D值并经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，放置于-20°C或4°C冰箱中保 存备用。
[0061] 二、采用SSR引物进行PCR扩增
[0062] 以步骤一得到的各个供试样本的基因组DNA为模板，分别用表2中的7对核心 SSR 引物对（SSR9008219, SSR9118060, SSR912