一种Oligo dT引物及构建cDNA文库的方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，提供了一种Oligo dT引物，该Oligo dT引物含有连续的dT序列的单链DNA分子，其含有用于切割的识别位点；所述用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、脱氧肌苷或硫代磷酸酯键。本发明还提供了一种基于上述OligodT引物进行cDNA文库构建的方法。本发明的OligodT引物适用性好，可应用于多种不同的建库方案；还能准确的定位在mRNA分子polyA尾的起始位点；本发明的构建cDNA文库的方法能够保证样品中所有的mRNA分子在构建的cDNA文库中得到特异性的体现。
【专利说明】-种Ol igo dT引物及构建cDNA文库的方法
[0001] 本案为2012年02月28日申请的，申请号为201210047909. 3,发明名称为《一种 Oligo dT引物及构建CDNA文库的方法》的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种Oligo dT引物，以及基于这种 Oligo dT引物进行cDNA文库构建的方法。
【背景技术】
[0003] 基因表达水平的分析，对研究基因功能起着至关重要的作用。基因表达序列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE),是一种快速分析基因表达信息的技术，它 通过快速和详细分析成千上万个表达序列标签（Expressed Sequenced Tags, EST)来寻找 出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组表达信息。SAGE技术与基因 芯片一起为目前两种最常见的基因表达谱研究方法。随着第二代测序技术的发展，通过构 建cDNA文库，然后利用第二代测序技术的高通量优势对mRNA文库进行测序，进而进行基因 表达谱分析的方法在基因表达谱研究中占有越来越重要的地位。
[0004] 真核生物的mRNA分子的5'端存在帽子结构，且往往还含有二级结构，因此，若要 成功构建5'端cDNA文库(该文库中各分子携带的待测标签来源于5'各mRNA分子的5' 端)，必须克服5'端帽子结构和5'端存在的二级结构的影响，难度较大。此外，即使得到 5'端cDNA文库，因为mRNA分子5'端GC含量较高，该文库中各分子携带的待测标签与各 mRNA分子的对应关系较差，使得这种文库在多种科学研究中的应用难度较高，用于mRNA分 子的表达谱分析时得到的结果不准确。还有，构建所得的5'端cDNA文库5'未端表现不足 (underrepresentation)是目前技术的固有限制，且由许多因素引起。其中最重要的一种因 素是由逆转录酶的延长过程的随机失效引起的。因为逆转录酶从mRNA的3'移动到5'末 端，所以一定百分比的逆转录酶可能从RNA模板解离，从而引起cDNA合成过早终止。另一 种起作用的因素是逆转录酶在mRNA二级结构区域暂停、减缓或停止。还有一种因素是由污 染性的RNA酶引入的，如果在由mRNA分子逆转录成双链cDNA分子的过程中，有极微量的污 染性RNA酶，那么，部分mRNA分子的5'未端会被污染性的RNA酶降解去除。上述情况对长 mRNA分子的影响尤其严重。因此，目前构建cDNA文库的现有技术中，构建3'端cDNA文库 是主流。而现有技术中常采用的Oligo dT引物为含有连续的dT序列的单链DNA分子，序 列可简写为：5' - (dT)n-3'，在整个文库的构建过程中仅具有分离纯化mRNA分子，将mRNA 分子反转录成双链cDNA的作用，对形成双链cDNA后的后续操作限制较大，能应用的建库方 法单一。
[0005] 目前，构建3'端cDNA文库的方法大致如下： (1) 利用Oligo dT引物将mRNA反转录并合成dscDNA ; (2) 锚定酶（anchoringenzyme，AE)NlaΠI酶切dscDNA，收集dscDNA的polyA/T部分 与最近的酶切位点之间的片段，得3' -cDNA ; (3) 在3' -cDNA的5'端接上接头I，得含有接头1的cDNA，该接头1为双链DNA分子， 包含Mme I酶切识别序列，其3'端含有CATG四碱基突出末端； (4) Mme I酶切含有接头1的cDNA，并回收含有接头1的酶切产物； (5) 在含有接头1的酶切产物的3'端接上接头2,从而获得两端连有不同接头序列的 cDNA文库，该接头2为双链DNA分子，其5'端为突出末端，含有两个通用碱基。
[0006] 上述方法中的锚定酶为序列特异性的限制性内切酶，当某些mRNA分子上无该锚 定酶的酶切位点时，这些mRNA分子在最终的cDNA文库中无法体现；又或者某些mRNA分子 上锚定酶的酶切位点不合适，使得后续的II s型限制性内切酶Mme I无法实现酶切，或者实 现Mme I酶切的位置在dscDNA的poly A/T部分，使得这些mRNA分子所形成的cDNA文库 分子中包含的特异性序列太短，无法实现与这些mRNA分子特异性的对应。即，上述方法无 法保证样品中所有的mRNA分子均能在cDNA文库中得到体现，进而使得后续的基因表达谱 分析结果不准确。
[0007] 因此需要一种新的Oligo dT引物，该引物适用性广，基于该引物形成的双链cDNA 分子对后续操作的限制小，能够应用于多种建库方法中；此外还需要一种新的cDNA文库构 建方法，该cDNA文库构建方法能够使样品中所有的mRNA分子在构建的cDNA文库中得到特 异性的体现。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种Oligo dT引物，解决现有技术中的Oligo dT引物适 用范围小，基于现有技术中的Oligo dT引物形成双链cDNA分子之后的操作限制大，应用其 建库方法单一的问题。
[0009] 为了实现发明目的，本发明提供了一种特殊设计的Olig0 dT引物，该Oligo dT引 物，适用性好，可应用于多种不同的建库方案；进一步的，该Oligo dT引物结构简单，能够 准确的定位在mRNA分子poly A尾的起始位点；且利用该Oligo dT引物进行cDNA文库的 构建，可避免部分mRNA分子在构建的cDNA文库中得不到特异性的体现的现象的出现。 [0010] 一种Oligo dT引物，为含有连续的dT序列的单链DNA分子，其含有用于切割的识 别位点。
[0011] 其中，该用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、脱氧肌苷、硫代磷酸酯键或II s型 限制性内切酶识别序列，所述II S型限制性内切酶识别序列在Oligo dT引物的5'端。
[0012] 其中，该Oligo dT引物序列为： 5' - (dT) XU (dT)厂3' ；或 5' - (RERS) - (dT) z-3' ； 或 5' - (dT) α (P-S) (dT)厂3' ；或 5' - (dT) γ (I) (dT) s-3' ；其中，x、y、ζ、α、 β、Y、δ均为自然数，RERS为含有II s型限制性内切酶识别序列的核苷酸序列，P-S为硫 代磷酸酯键，I为脱氧肌苷。
[0013] 其中，该Oligo dT引物的3'末端为含通用碱基的核苷酸M，M为A或G或C。
[0014] 进一步的，该Oligo dT引物的3'末端为两个含通用碱基的核苷酸，从5'端至3' 端依次为M和N，N为A或G或C或T或U或I ;所述Olig0 dT引物序列为： 5, - (dT)xU (dT)yMN-3,；或 5, - (RERS)- (dT)zMN-3,； 或 5' - (dT) α (P-S) (dT) eMN-3' ；或 5' - (dT) γ (I) (dT) sMN-3' ；其中，x、y、z、 α、β、Y、δ均为自然数，RERS为含有II s型限制性内切酶识别序列的核苷酸序列，P-S为 硫代磷酸酯键，I为脱氧肌苷。
[0015] 更进一步的，x+y > 14, z > 15，α + β > 14，Y + δ > 14。
[0016] 其中，所述Oligo dT引物含有标记物，所述标记物采用生物素、抗原、抗体、受体、 配体、多聚组氨酸中的至少一种。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种新的CDNA文库构建方法，旨在解决现有技术不 能保证样品中所有mRNA分子均能在cDNA文库中得到特异性体现的问题。
[0018] 基于上述特殊设计的Oligo dT引物，本发明提供了一种cDNA文库构建方法，包括 以下步骤： A. 利用Oligo dT引物反转录mRNA，形成第一条cDNA链，得RNA/DNA杂合分子；该Oligo dT引物为含有连续的dT序列的单链DNA分子，其含有用于切割的识别位点； B. 对RNA/DNA杂合分子中的第一条cDNA链进行扩增，得双链cDNA ; C. 利用II s型限制性内切酶酶切双链cDNA，得含mRNA分子3'端对应序列的片段； D. 含mRNA分子3'端对应序列的片段与第一接头分子连接，得cDNA文库。
[0019] 其中，该用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、脱氧肌苷、硫代磷酸酯键或II S型 限制性内切酶识别序列，所述II S型限制性内切酶识别序列在Oligo dT引物的5'端。
[0020] 其中，该用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷；该步骤 C包括以下步骤： C01.切割剂切割双链CDNA，得双链切割片段； C02.将双链切割片段与第二接头分子连接，得第一连接产物； C03.利用第一 II s型限制性内切酶酶切第一连接产物，得含mRNA分子3'端对应序列 的片段； 所述切割剂用于特异性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷3'端的第二个磷酸二酯 键。
[0021] 进一步的，该Oligo dT引物序列为： 5, - (dT) XU (dT)厂3,；或 5, - (dT) α (P-S) (dT)厂3,； 或 5' - (dT) γ (I) (dT) s-3' ；其中，x、y、α、β、Υ、δ 均为自然数，14 彡 x+y 彡 17， 14彡α + β彡17,14彡γ + δ彡17, P-S为硫代磷酸酯键，I为脱氧肌苷。
[0022] 其中，该用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷；该步骤 C包括以下步骤： C11.切割剂切割双链cDNA，得双链切割片段； C12.将双链切割片段与第二接头分子连接，得第一连接产物； C13.利用第一 II s型限制性内切酶酶切第一连接产物，得不含第二接头分子的酶切片 段； C14.将不含第二接头分子的酶切片段与第三接头分子连接，得第二连接产物； C15.利用第二II s型限制性内切酶酶切第二连接产物，得含mRNA分子3'端对应序列 的片段； 所述切割剂用于特异性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷3'端的第二个磷酸二酯 键。
[0023] 进一步的，该Oligo dT引物序列为： 5, - (dT) XU (dT)厂3,；或 5, - (dT) α (P-S) (dT)厂3,； 或 5' - (dT) γ (I) (dT) s-3' ；其中，X、y、α、β、Υ、δ 均为自然数，χ+y 彡 14 ; 3<χ<9, α+β 彡 14,3< α <9, γ + δ 彡 14,3< γ <9。
[0024] 其中，该用于切割的识别位点为II s型限制性内切酶识别序列，其位于Oligo dT 引物的5'端；该步骤C具体为： II s型限制性内切酶酶切双链cDNA，分离纯化出含有Oligo dT引物对应序列的酶切产 物，得含mRNA分子3'端对应序列的片段。
[0025] 进一步的，该Oligo dT引物序列为： 5' - (RERS)- (dT)z-3';其中，RERS为含有II s型限制性内切酶识别序列的核苷酸序 列，z为自然数，10彡z彡17。
[0026] 其中，该用于切割的识别位点为II s型限制性内切酶识别序列，其位于Oligo dT 引物的5'端；该步骤C具体为： C21. II s型限制性内切酶酶切双链cDNA，分离纯化出无 II s型限制性内切酶识别序列 的酶切片段； C22.将无 II s型限制性内切酶识别序列的酶切片段与第四接头分子连接，得第三连接 产物； C23.利用第三II s型限制性内切酶酶切第三连接产物，得含mRNA分子3'端对应序列 的片段。
[0027] 进一步的，该Oligo dT引物序列为： 5' - (RERS)- (dT)z-3';其中，RERS为含有II s型限制性内切酶识别序列的核苷酸序 列，z为自然数，15彡z彡30。
[0028] 其中，在步骤A之前还包括步骤A':利用Oligo dT引物从总RNA中分离纯化mRNA。
[0029] 其中，上述任意方案中，所述Oligo dT引物的3'末端可为含通用碱基的核苷酸M， M为A或G或C。
[0030] 进一步的，该Olig0 dT引物的3'末端可为两个含通用碱基的核苷酸，从5'端至 3'端依次为M和N，N为A或G或C或T或U或I ;所述Olig0 dT引物序列为：
【权利要求】
1. 一种Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物为含有连续的dT序列的单链 DNA分子，其含有用于切割的识别位点；所述用于切割的识别位点为尿嘧啶核苷酸、脱氧肌 苷或硫代磷酸酯键。
2. 根据权利要求1所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物序列为： 5, - (dT) XU (dT)厂3,；或 5, - (dT) a (P-S) (dT)厂3,； 或5' - (dT) Y (I) (dT) s_3' ；其中，x、y、a、p、Y、S均为自然数，P-S为硫代磷酸 酯键，I为脱氧肌苷。
3. 根据权利要求1所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物的3'末端 为含通用碱基的核苷酸M, M为A或G或C。
4. 根据权利要求3所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引物的3'末端 为两个含通用碱基的核苷酸，从5'端至3'端依次为M和N，N为A或G或C或T或U或I ; 所述Oligo dT引物序列为： 5' - (dT)xU (dT)yMN-3,；或 5' - (dT) a (P-S) (dT) eMN-3' ； 或5'- (dT)Y (I) (dT)sMN_3,；其中，x、y、a、Y、S均为自然数，I为脱氧肌 苷。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的Oligo dT引物，其特征在于，所述Oligo dT引 物含有标记物，所述标记物采用生物素、抗原、抗体、受体、配体、多聚组氨酸中的至少一种。
6. -种cDNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤： A. 利用Oligo dT引物反转录mRNA，形成第一条cDNA链，得RNA/DNA杂合分子；该Oligo dT引物为含有连续的dT序列的单链DNA分子，其含有用于切割的识别位点；所述用于切割 的识别位点为尿嘧啶核苷酸、脱氧肌苷或硫代磷酸酯键； B. 对RNA/DNA杂合分子中的第一条cDNA链进行扩增，得双链cDNA ; C. 利用II s型限制性内切酶酶切双链cDNA，得含mRNA分子3'端对应序列的片段； D. 含mRNA分子3'端对应序列的片段与第一接头分子连接，得cDNA文库。
7. 根据权利要求6所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤： C01.切割剂切割双链cDNA，得双链切割片段； C02.将双链切割片段与第二接头分子连接，得第一连接产物； C03.利用第一 II s型限制性内切酶酶切第一连接产物，得含mRNA分子3'端对应序列 的片段； 所述切割剂用于特异性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷3'端的第二个磷酸二酯 键。
8. 根据权利要求7所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述Oligo dT引物序列 为： 5, - (dT) XU (dT)厂3,；或 5, - (dT) a (P-S) (dT)厂3,； 或 5' - (dT) Y (I) (dT) s_3' ；其中，x、y、a、3、Y、S 均为自然数，14 彡 x+y 彡 17， 14彡a + p彡17,14彡Y + S彡17, P-S为硫代磷酸酯键，I为脱氧肌苷。
9. 根据权利要求6所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤： C11.切割剂切割双链cDNA，得双链切割片段； C12.将双链切割片段与第二接头分子连接，得第一连接产物； C13.利用第一 II s型限制性内切酶酶切第一连接产物，得不含第二接头分子的酶切片 段； C14.将不含第二接头分子的酶切片段与第三接头分子连接，得第二连接产物； C15.利用第二II s型限制性内切酶酶切第二连接产物，得含mRNA分子3'端对应序列 的片段； 所述切割剂用于特异性切割尿嘧啶、硫代磷酸酯键或脱氧肌苷3'端的第二个磷酸二酯 键。
10. 根据权利要求9所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述Oligo dT引物序列 为： 5, - (dT) XU (dT)厂3,；或 5, - (dT) a (P-S) (dT)厂3,； 或 5' - (dT) Y (I) (dT) s-3' ；其中，x、y、a、3、Y、S 均为自然数，x+y 彡 14， 3<x<9, a+@ 彡14,3< a <9, Y + S 彡 14,3< Y <9。
11. 根据权利要求6所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，在步骤A之前还包括步骤 A' ：利用Oligo dT引物从总RNA中分离纯化mRNA。
12. 根据权利要求6、7、9或11所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述Oligo dT 引物的3'末端为含通用碱基的核苷酸M，M为A或G或C。
13. 根据权利要求12所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述Oligo dT引物的 3'末端为两个含通用碱基的核苷酸，从5'端至3'端依次为M和N，N为A或G或C或T或 U或I ;所述Oligo dT引物序列为： 5' - (dT)xU (dT)yMN-3,；或 5' - (dT) a (P-S) (dT) eMN-3' ； 或5'- (dT)Y (I) (dT)sMN_3,；其中，x、y、a、Y、S均为自然数，I为脱氧肌 苷。
14. 根据权利要求6至11、13中任一项所述的cDNA文库构建方法，其特征在于，所述 Oligo dT引物在5'端含有标记物，该标记物采用生物素、抗原、抗体、受体、配体、多聚组 氨酸中的至少一种；和/或所述接头分子含有标记物，该标记物采用生物素、抗原、抗体、受 体、配体、多聚组氨酸中的至少一种。
【文档编号】C12N15/11GK104388426SQ201410728545
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2012年2月28日 优先权日:2012年2月28日
【发明者】盛司潼 申请人:盛司潼