专利名称：一种camv35s基因检测用引物、相应的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及检验检测领域，具体涉及一种CAMV35S基因检测用引物、相应的试剂 盒及检测方法。
背景技术：
CAMV35S基因为花椰菜花叶病毒的35S启动子，广泛应用于转基因大豆、玉米、油 菜、马铃薯及番茄等转基因农作物。为了加强对转基因产品的监督和管理，目前发展了多种转基因成分检测方法，从 基于蛋白质的ELISA检测技术到基于核酸的聚合酶链式反应(PCR)技术以及快速发展的 基因芯片技术。其中PCR检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，这种技术通过 检测转基因产品中含有的外源核酸片段来鉴定，随着荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)的出现，不仅能够进行转基因产品的定性鉴定，而且可以对转基因成分进行定 量。以PCR技术为代表的转基因产品检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普 通PCR技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而Real time PCR技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的 定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧 光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。基因芯片技术能够实现快速和高通量的检 测，然而价格昂贵，检测成本高。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足转基因产 品检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增(Isothermal Amplification)核酸 快速检测技术是转基因产品检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplication of DNA,简称 LAMP)具有很多的优越性，且目 前也未见有用环介导等温扩增技术检测转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于根据现有诊断CAMV35S基因中存在的成本高。设备复杂、不利 于快速检测等问题，提供一种快速、简单、成本低、设备简单的CAMV35S基因检测用引物。本发明另一目的在于提供包含上述CAMV35S基因检测用引物的试剂盒。本发明还有一个目的在于提供一种快速检测CAMV35S基因的方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明的转基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因检测用引物组，是基于环介导等 温扩增技术，根据已公开的转基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因序列，选取转基因 农作物及其加工产品中CAMV35S基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别转 基因农作物及其加工产品中CAMV35S基因的特异性引物组，通过PCR来鉴定转基因农作物 及其加工产品中CAMV35S基因，该引物组由如下四条引物组成 外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或6所示; 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或7所示; 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4或8所示。本发明的转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、fei DNA聚 合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液组成，上述每IL反应液中含有1.6 2mmol dNTP、2(T25mmol Tris-HCl、10 12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol 硫酸铵、8 IOmmol 硫酸镁、 Γ . 25ml TritonX-100、0. 8 Imol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 1. 6 2 μ mol 和外引物 F3/ B3各0. 2 0. 25 μ mol ；优选的比例是每IL反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、 12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内 引物 FIP/BIP 各 2 μ mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25 μ mol。上述显色液优选为荧光染料STOR Green I或EvaGreen。
上述稳定液优选为石蜡油。上述阳性对照为CAMV;35S基因DNA片段。本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺
1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液无菌分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法 1、样品处理
待测样品中DNA的提取和含量测定按国标按照GB/T 19495. 3-2004中的规定执行。对 样品进行DNA提取时要保证DNA的质量和浓度的稳定，以保证PCR反应的可重复性。要确 保提取的DNA片段大于扩增片段。2、环介导等温扩增技术反应过程
在反应管中加入反应液38 40体积％，Bst DNA聚合酶大片段0. 9 1. 8体积％，稳定 液52 54. 5体积％，样品模板DNA 4. 5、体积％，63 65°C恒温反应45 90min。所述体积百分 比是指占四个组分总体积的体积百分比。3、反应后处理
在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为 阳性，否则为阴性。本发明的原理是利用fei DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外 引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环 链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很 多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子 与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定 结果。LAMP反应是在恒温(63飞5°C)条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条 件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及 检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种 简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定 量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当 于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检 测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂 与设备，检测成本低；
2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶 标物质的存在与否，因此具有高特异性；
3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产
率尚；
4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；
5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴 阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
图1为实施例4中试剂盒特异性检测结果图；其中，1为ddH20，2为TE缓冲液，3 为大米非转基因样品W818 DNA，4为大豆非转基因样品W794 DNA，5为25ng大豆转基因样 品W562 DNA，6为50ng大豆转基因样品W562 DNA，7为IOOng大豆转基因样品W562 DNA, 8为250ng大豆转基因样品W562 DNA。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步地阐述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。实施例1转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒的制备 (1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物
外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或6所示; 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或7所示; 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4或8所示。(2)购置DNA聚合酶-.Bst DNA polymerase (大片段)，置于容器。(3)配制反应液反应液的配方按每IL溶液含有2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl, 12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、1.25ml TritonX-100、Imol 甜菜碱、内 引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0. 25mol配制，置于容器。(4)购置稳定液石蜡油，置于容器。(5)购置显色液STOR Green I，置于容器。(6)提取阳性对照制备CAMV35S基因DNA片段分别置于容器。
(8)将上述5个容器装成试剂盒，封装。制备工艺简述如下
1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。实施例2转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒的应用
本实施例采用实施例1制备的转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒进行待测样品 中CAMV35S基因的快速诊断。1、样品处理(模板DNA提取)
1)将IOOmg经预处理的试样，在液氮中充分研磨成粉末后加人700μ L CTAB提取缓
冲液I中(不需研磨的试样直接加
入)，振荡后混勻，65°C保温30 min，其间不时轻缓颠倒混勻2_3次。2)加人700μ L三氯甲烷-异戊醇，轻缓颠倒混勻溶液2_3次。12000g离心5 min
至分相。3)将上清液转移至干净的离心管中，加人0.6倍体积的4°C预冷的异丙醇， 于-20°C静置 5min，12 000 g 离心 5 min。4)弃上清液，加入IOOOPL 70%乙醇，轻轻转动离心管，4°C下8000g离心1 min， 弃上清液后，再加入20μ L Rnase A酶(10μ g /μ L)，37°C温浴30min。5)加入600μ 氯化钠溶液，65°C温浴lOmin。加入600μ 三氯甲烷-Tris饱和酚， 颠倒混勻后，12000g离心5 min，转移上清液至1. 5mL离心管中。6)加人0. 6倍体积的4°C预冷的异丙醇，于4°C静置30min，12 000 g离心10 min,
弃去上清液。7)加入1000 μ 4°C预冷70%乙醇，轻轻转动离心管，4°C下12 000 g离心10 min,
弃上清液。重复一次操作。室温下挥发液体。8)沉淀干燥后，加入50μ TE缓冲液充分溶解DNA，_20°C保存备用。2、环介导等温扩增技术的反应过程
1)在200μ1反应管配制反应体系反应液22μ1，^ DNA聚合酶0. 5μ1 (4U)，模板 DNA 2. 5 μ 1。2)将配制好的反应管于64°C恒温反应lh。3、反应后处理
向上述PCR反应产物中加入2μ 1 SYBR Green I，混勻，同时也向阳性对照管中加入 SYBR Green I混勻，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴性。实施例3转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒的特异性验证
本实施例采用实施例1制备的转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒进行试剂盒的 特异性检测。
采用实施例1制备的转基因作物CAMV35S基因快速诊断试剂盒，分别对大豆转基 因样品W562、大豆非转基因样品W794、大米非转基因样品W818、ddH20和TE缓冲液进行扩 增，非转基因样品DNA分别加入250ng，大豆转基因样品DNA分别加入250ng、100ng、50ng和 25ng,每个样品设置2个重复。反应体系为反应液22Pl、fei DNA聚合酶0. 5μ1、稳定液30μ1和DNA模板 2. 5μ1。反应程序金属浴中65°C，1小时。反应完毕后加入显色液2. Ομ ，观察结果，如表1和图1所示。
权利要求
1.一种CAMV35S基因检测用引物，其特征在于由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内 引物BIP组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:广4所示。
2.—种CAMV35S基因检测用引物，其特征在于由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内 引物BIP组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0:5 8所示。
3.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求1或2所述CAMV35S基因检测用引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由权利要求1所述CAMV35S 基因检测用引物、fei DNA聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液组成；其中，所述 反应液的配方为每IL反应液中含有1. 6 2mmol dNTP、2(T25mmol Tris-HCl,10^12. 5mmol 氯化钾、10 12. 5mmol硫酸铵、8 IOmmol硫酸镁、广1. 25ml TritonX-100,0. 8 Imol甜菜碱、 内引物FIP/BIP各1. 6^2mol和外引物F3/B3各0. 2^0. 25mol ；所述阳性对照为CAMV35S基 因DNA片段。
5.根据曲安咯要求4所述的试剂盒，其特征在于所述显色液为STORGreen I或 EvaGreen0
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述每IL反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl,12. 5mmol 氯化钾、12. 5mmol 硫酸铵、IOmmol 硫酸镁、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜碱、内引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述稳定液位石蜡油。
8.利用权利要求3所述试剂盒检测CAMV35S基因的方法，其特征在于包括如下步骤(1)待测样品DNA的制备；(2)在反应管中加入反应液38 40体积％，BstDNA聚合酶0. 9 1. 8体积％，稳定液 52 54. 5体积％，样品模板DNA 4. 5、体积％，恒温反应；(3)在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则 为阳性，否则为阴性。
9.根据权利要求8所述的检测CAMV35S基因的方法，其特征在于步骤(2)中，所述恒温 反应的温度为63 65°C，反应时间为45 90min。
全文摘要
本发明公开了一种CAMV35S基因检测用引物、相应的试剂盒及检测方法。本发明CAMV35S基因检测用引物由外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~4所示。本发明所述引物根据是否扩增就能判断靶标物质存在与否，具有高度特异性；本发明试剂盒可以快速诊断CAMV35S基因，只需一个恒定温度就能扩增，不需要特殊试剂或设备，检测成本低，适合推广应用。
文档编号C12Q1/68GK102140516SQ20111000379
公开日2011年8月3日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者曹以诚, 李志勇, 杜正平, 谭慧媚, 陈洵, 高东微 申请人:广州华峰生物科技有限公司