专利名称：一种鉴定西施舌种类的aflp选择性引物及方法
技术领域：
本发明涉及生物检测鉴定技术，尤其涉及一种西施舌种类的AFLP鉴定引物和方法。
背景技术：
西施舌俗称“海蛘”，个体较大，营养丰富，肉质细嫩，滋味鲜美，可与海参、鲍鱼媲美，是一种经济价值很高的名贵海产贝类。除此之外，西施舌还具有极高的医疗保健价值， 是一种高蛋白、低脂肪、低胆固醇的食物，具有降低尿糖的功效。近年来，随着市场需求的增加，野生西施舌资源由于滥捕而锐减，目前，西施舌的养殖已经在试验之中，预计今后也将逐步得到发展。西施舌在我国沿海均有分布，但是价格却差别很大，福建与广西沿海的西施舌由于环境特殊，所产的西施舌品质、风味更胜其它地区产的西施舌，价格上高出许多，有研究已经证明福建、广西沿海的西施舌与其它地区的西施舌已经分化成了两个亚种。新鲜的或未经加工的西施舌，一般人很难从其贝壳的形态加以识别，长期从事西施舌相关行业的人士或可从外形分辨，但是经过加工的产品则无法从形态上判断是产于哪个海区的西施舌。 这样很容易出现一些以次充好后高价出售的现象。为此需要一种灵敏可靠的从加工品鉴别原料西施舌种类的技术。不同种生物其基因序列间通常存在着比较固定的差异，因此可以根据基因组DNA 序列的不同进行物种鉴别，这种方法不受生物生长发育状态的影响，鉴别的准确性很高。其中最可靠的方法是克隆出某个基因或DNA片段进行测序，但是测序的操作复杂，成本也比较高。对于鱼类已经有人建立了抽提线粒体DNA，用多种限制性内切酶对线粒体DNA进行切割，根据酶切结果的差异识别与鉴定鱼类加工品的原材料鱼种的方法，但是这种方法需要较多的组织样品来抽提线粒体DNA。PCR技术是一种非常灵敏的体外DNA扩增技术，它同时具有很高的特异性，通过设计适宜的引物和控制适宜的反应条件，利用它可以鉴别出受检DNA上微小的序列差异，已经被广泛应用到生命科学研究众多领域，及至刑侦、法医鉴定领域。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定西施舌种类的AFLP选择性引物及鉴定方法，为形态上不便于鉴别的西施舌进行种类的鉴定。为解决上述问题，本发明提供一组引物，其序列是SEQ N0:1和SEQ NO:2 ；和或SEQ NO:3 禾口 SEQ NO:4;和或 SEQ NO:5 禾口 SEQ NO:6。E-ACA/M-CGTI 选择性引物5，-GACTGCGTACCAATTCACA-3，( SEQ NO: 1) i&el 选择性引物5，-GATGAGTCCTGAGTAACGT-3，( SEQ N0:2)
E-ACT/M-CGT -.EcoR I 选择性引物5，-GACTGCGTACCAATTCACT-3，( SEQ N0:3) i&el 选择性引物5，-GATGAGTCCTGAGTAACGT-3，( SEQ N0:4)E-AGA/M-CGT -.EcoR I 选择性引物5，-GACTGCGTACCAATTCAGA-3，( SEQ NO:5) i&el 选择性引物5，-GATGAGTCCTGAGTAACGT-3，( SEQ NO:6) 为解决上述问题，本发明提供一种鉴定方法，其具体步骤为 提取西施舌DNA ；所述西施舌DNA可以是来源于西施舌足部的肌肉。Mse I和I双酶切所述提取的西施舌DNA得到酶切片断；
将人工合成的接头在T4 DNA连接酶作用下连接到所述酶切片断的两端，形成带有接头的片断，接头序列是SEQ NO: 7 禾Π SEQ NO: 8，SEQ NO: 9 和 SEQ NO: 10 ；SEQ NO: 7 和 SEQ NO: 8 合成的时候是以DNA双链的形式，形成粘性末端，才能和双酶切片段在T4连接酶的作用下连接，SEQ N0:9 和 SEQ NO: 10 同理。具体为EcoR I 接头序列5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，( SEQ N0:7) 5， -AATTGGTACGCAGTCTAC-3， ( SEQ NO:8)
Mse I 接头序列5，-GACGTGAGTCCTGAG-3，( SEQ N0:9) 5， -TACTCAGGACTCAT-3， ( SEQ NO:10)
PCR预扩增所述带有接头的片断，预扩增引物为SEQ N0:11和SEQ N0:12 ;PCR反应体系 10-20 μ L 步骤 3 所述连接产物 0. 5-1 μ L ；IXPCR 缓冲液(含 Mg2+) ；dNTPs 0. 2 mM -,EcoR I 和i&el 选择特异性引物各 0. 25 μ M ；Taq 酶 0. 5_1U。94°C变性 5min，(94°C变性 30s, 53°C 退火30s, 72°C延伸Imin)共20个循环，72°C终延伸IOmin ；
EcoR I 预扩增引物的序列5，-GACTGCGTACCAATTCA-3，( SEQ N0:11) MseI 预扩增引物的序列5，-GATGAGTCCTGAGTAAC-3，( SEQ N0:12) 选择性 PCR 扩增分别用 SEQ NO: IiPSEQ NO: 2 ；SEQ NO: 3 禾口 SEQ NO: 4 ；SEQ NO: 5 禾口 SEQ N0:6三对引物进行选择性PCR扩增。稀释20倍后的预扩增产物进行选择性PCR扩增， PCR扩增反应体系10-20μ L 预扩增产物0. 1-0. 2μ L ；IXPCR缓冲液(含Mg2+) ； dNTPsO. 2 mM -,EcoR I和i&el选择特异性扩增引物各0. 25 μ M ；Taq酶0. 5_1U。PCR循环条件先94°C 变性5min，再95°C变性30s，65降至56°C，72°C延伸lOmin，每循环降低0. 9°C，共10个循环，再95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共25个循环，72°C最终延伸IOmin ；
PCR产物电泳检测将所得到的选择性PCR扩增产物进行电泳，观察，PCR产物出现 148bp和^Obp特异性条带的，即为福建沿海和广西沿海所产的西施舌；PCR产物出现85bp 和IOObp特异性条带的，即为山东沿海和江苏沿海所产的西施舌。本发明根据用两种限制性内切酶将西施舌基因组DNA进行限制性酶切，再将特定的接头连接在限制性内切酶作用下产生大小不等的DNA片段两端，形成一个带接头的特异性片段，以此为模板，以接头序列和限制性内切酶的切点序列为基础设计引物，通过对受检材料进行PCR扩增，在用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无预期的特异性扩增条带出现，据此即可准确地对受检材料进行物种鉴定。其特点是灵敏、准确。该方法可用于鉴别从外表形态无法分辨的不同种或不同产区的西施舌，并可对其进行所属物种或产区的鉴定；也可用于鉴定西施舌加工品是使用什么种类或产区的西施舌为原料加工而成，在商业上和生态学等科学研究上都有应用价值。所说的西施舌主要为我国东南沿海所产，例如福建、广西沿海产西施舌和山东、江苏沿海产西施舌。本发明还提供一种鉴定西施舌种类的试剂盒，包括SEQ N0:1和SEQ N0:2 ；和或 SEQ N0:3 禾口 SEQ N0:4;和或 SEQ N0:5 禾口 SEQ N0:6 引物。
图1为四种不同地区(福建沿海、广西沿海、山东沿海和江苏沿海)的西施舌的PCR 选择性扩增电泳图谱，其中泳道1为广西沿海西施舌野生群体，泳道2为福建沿海西施舌子一代群体，泳道3为福建沿海西施舌野生群体，泳道4为江苏沿海西施舌野生群体，泳道5 山东沿海西施舌野生群体，每两群体之间为DNA Ladder (30-330 bp AFLP DNA Ladder, Invitrogen)。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例不同种类西施舌鉴定方法
1、 DNA提取取福建沿海的西施舌足部肌肉10-25mg，研磨，然后用蛋白酶K-苯酚-氯仿法或DNA抽提试剂盒提取总DNA，然后用灭菌超纯水或TE溶解。TE溶液为IOmM pH8. 0 Tris-HCiamM EDTA (广西沿海、山东沿海和江苏沿海的西施舌处理同此)。酶切取上述抽提的总DNA，用i&e I (Fermentas公司)和I (Fermentas公司)两种限制性内切酶在各自最适温度下将总DNA进行充分酶切，酶切条件和体系如下
将DNA浓度稀释为IOOng/ μ L，并用限制性内切酶i&el进行第一步酶切，酶切条件为 65 0C 3h，酶切体系18μ L
权利要求
1.一组用于鉴定西施舌种类的AFLP选择性引物，其序列是SEQ NO: 1和SEQ N0:2;和或 SEQ NO:3 禾口 SEQ NO:4;和或 SEQ NO:5 禾口 SEQ NO:6。
2.一种西施舌种类鉴定AFLP方法，其步骤为 提取西施舌DNA ；Mse I和I双酶切所述提取的西施舌DNA得到酶切片断； 将人工合成的接头在T4 DNA连接酶作用下连接到所述酶切片断的两端，形成带有接头的片断，接头序列是 SEQ NO:7 禾口 SEQ NO:8，SEQ NO:9 禾口 SEQ NO: 10 ；PCR预扩增所述带有接头的片断，预扩增引物为SEQ NO: 11和SEQ NO: 12 ； 选择性PCR扩增用权利要求1所述的引物对稀释后的预扩增产物进行选择性PCR扩增，PCR循环条件先94°C变性5min，再95 °C变性30s，65 °C逐渐降至56 °C，72 °C延伸IOmin， 每循环降低0. 9°C，共10个循环，再95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，共25个循环，72 °C最终延伸IOmin ；PCR产物电泳检测将所得到的选择性PCR扩增产物进行电泳，观察，如果PCR产物出现148bp和^Obp特异性条带，即为福建沿海和广西沿海所产的西施舌；如果PCR产物出现 85bp和IOObp特异性条带，即为山东沿海和江苏沿海所产的西施舌。
3.权利要求2所述的西施舌种类鉴定AFLP方法，其特征在于所述提取的西施舌DNA 来源于西施舌足部的肌肉。
4.一种鉴定西施舌种类的试剂盒，包括权利要求1所述的AFLP选择性引物。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定西施舌种类的AFLP选择性引物及方法。所述方法包括DNA提取，酶切，连接，预扩增，选择性扩增和电泳检测。根据PCR扩增条带，来判断是哪种西施舌。本方法灵敏、准确，可用于鉴别从外表形态无法分辨的不同种或不同产区的西施舌，并可对其进行所属物种或产区的鉴定；也可用于鉴定西施舌加工品是使用什么种类或产区的西施舌为原料加工而成，在商业上和生态学等科学研究上都有应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102373279SQ20111033702
公开日2012年3月14日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者王展林, 黎中宝 申请人:集美大学