一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种rDNA?ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，包括：（1）采集西施舌个体，提取DNA；（2）合成rDNA的ITS2序列标记引物；（3）对西施舌群体样品进行ITS2序列的PCR扩增；（4）对PCR产物进行纯化；（5）对纯化的PCR产物进行测序和序列比对，得出特异性位点，判断样品所属。本发明结果稳定，可重复性强，鉴别方法简单，对该贝类的种质资源保护和科学利用具有重要意义。
【专利说明】一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鉴定西施舌种质领域，特别涉及一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法。
【背景技术】
[0002]西施舌[CoelomactraantiquataCSpengler, 1802)]隶属于软体动物(mollusca)瓣觸纲(Lamellibranchia),异齿亚纲(Heteridonta),帘蛤目(Veneroida),蛤蜊科(Mactridae),腔蛤蜊属(Coelomactra)贝类，中文俗名有:“海蛘”、“红蛋”、“贵妃蛘”等；贝壳外表略呈三角形，壳薄且脆，壳表近顶部呈粉紫色；在自然海区，I龄壳长为4~6cm，重约20g ;2龄壳长可达8cm，重IlOg左右；3龄壳长可达IOcm以上，重超过150g，大者可达250g以上。西施舌不仅个体大、肉质细嫩、味道鲜美，而且含有多种营养成分、贝壳外观色泽好看，是一种食药兼备的海产名贵贝类。
[0003]西施舌在我国南北沿海均有分布，以山东、江苏、福建、广东等地资源较为丰富。但近十几年来，西施舌自然资源量不断减少，其生长区域不断缩小已呈现出片段化趋势。由于产量很少，西施舌在这些产地的市场上也很难看到，供不应求，价格连年攀升。针对西施舌的资源状况，福建省已于1985年在长乐海区建立了 “福建省长乐海蛘资源增殖省级自然保护区”，对捕捞量进行限制。大量研究表明，由于海区各自独特的地理生态环境，西施舌的南北不同地理群体在种质信息上已经存在明显遗传分化，应作为不同的种质管理单元。由于不同群体西施舌表型相近，因此依靠表型进行群体鉴别相当困难。随着人工养殖的苗种异地移引，这在一定程度上容易造成种质的混淆及不良影响；如何区分不同地区来源种苗与后期亲贝选择等，成为西施舌种质资源保护和良种选育工作重要的课题。
[0004]目前未有针对西施舌不同群体的分子标记鉴定方法。ITS2序列是介于5.8S和28S rRNA基因之间的非编码`序列，因其在核糖体rDNA整体结构功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有较高的可变性，其序列在不同种类、或同种的不同个体中都可能存在较大差异，因此，利用ITS2序列作为西施舌群体鉴定标记具既简明又可靠的特性。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，该方法结果稳定，可重复性强，鉴别方法简单。
[0006]为实现本发明的目的，本发明的技术方案是:
[0007]一种利用rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，该方法包括以下步骤:
[0008](I)采集不同群体的西施舌个体，取西施舌样品的闭壳肌组织，提取基因组总DNA，洗脱定溶于TE溶液或双蒸水中，-20°C保存，备用时于4°C保存；
[0009](2)以 I T S 2 -F: 5 ' —GGGTCGATGAAGAACGCAG — 3 ' 和ITS2-R:5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'为引物，进行 ITS2 序列的 PCR 扩增；然后 PCR 扩增产物经1.2%-l.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测完毕进行切胶并利用PCR产物纯化试剂盒纯化回收,纯化产物进行双向测序列,其中无法直接测序的PCR产物，经克隆并进行菌落PCR检验后再测序；应用软件进行不同序列比对，得出特异性位点，判断样品所属。
[0010]所述步骤(1)中的TE溶液浓度为IOOng/ U I。
[0011]所述步骤(2)中的PCR扩增的反应体系为30 iiL，每个反应体系内含:50ng/iiL的模板 DNAl ii L，20mM Mg2+的 10Xbuffer2.5 y L，5mM each dNTPl.0 y L，5 y M 的引物各
1.0u L, Taq 酶聚合酶 IU，加 ddH20 M 30 U L0
[0012]所述步骤(2)中的PCR扩增反应具体为:反应前94°C预变性4min，接着为35个循环的反应，条件为 940C 40s, 520C 30s, 72°C 60s，最后 72°C延伸 7min。
[0013]所述步骤(2)中以DL500标准DNA Marker为分子量标识进行切胶。
[0014]所述步骤(2)中的克隆具体为:将纯化好的PCR产物片段连接入载体中T-easyVECTOR，体系IOii L:其中T4连接酶1U，2X快速连接buffer5 yl，PCR产物2 y L，T载体I u L ;16°C反应lh，将全部连接产物加入100 iil的JM109感受态细胞进行转化，转化过的含感受态细胞的菌液均匀涂布于添加IPTG和X-gal的氨苄青霉素LB平板上，37°C培养培养过夜；挑选白色单一菌落，接种于450 ii L的LB培养液中，37°C震荡培养到指数级生长或可见云雾状；取I U L培养液做菌落PCR，检测插入的片段，选2个阳性克隆进行测序。
[0015]所述IPTG用量为100 iil，浓度为10mmol/L ;X-gal用量为100 yl，浓度为2% ;培养过夜具体为培养16h。
[0016]所述步骤(2)中的菌落PCR反应条件为:15iiL的反应体系:Mg2+2.5mmol/L，dNTP0.25mmol/L，引物0.2`5 u mol/L, Taq酶IU ;反应条件为94°C预变性5min，之后进行30循环:94°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸120s ;最后，72°C延伸5min。
[0017]有益.效果
[0018]本发明采用ITS2序列作为鉴定标记，由于序列的变异位点少又稳定，可快速高效实现对不同群体样品的准确鉴定；有利于避免不同来源西施舌苗种或成贝的混淆，尤其是遗传育种中对选择亲贝的鉴定；对该贝类不同地理群体自然产区的种质管理、资源保护和科学利用具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为不同群体西施舌个体样品的rDNA ITS2序列的特异碱基比较；其中:Hap-l-Hap-5 为 QD 群体，Hap-6—Hap-1O 为 CL 群体。
[0020]图2A-E为西施舌长度为400bp的38个rDNA ITS2序列的比对结果；其中:“.”表示江苏山东群体和福建长乐群体的保守位点，“r’表示鉴别来自江苏山东群体和福建长乐群体(CL)的碱基位点，RZ, JM, QD和GY分别表示来自山东的日照、即墨，及江苏的启东、赣榆的西施舌个体序列，其余序列为从NCBI数据库下载用于比较。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0022]实施例1
[0023]I)不同来源的样本采集及DNA提取:
[0024]在我国山东即墨(JM)、日照(RZ)，江苏省的赣榆(GY)、启东(QD)，及福建省长乐(CL)等海区采集自然生长的西施舌个体。用灭菌的解剖刀及镊子取样品的闭壳肌组织。基因组总DNA提取可采用DNA提取试剂盒或酚氯仿提取法。最后，紫外分光光度计测定样品DNA的0D260、0D280值，确定其浓度和纯度，母液置于_20°C保存。备用时DNA浓度IOOng/ul于4°C保存。
[0025]2) PCR扩增条件:
[0026]引物碱基序列分别为:
[0027]ITS2-F(2A):5' -GGG TCG ATG AAG AAC GCA G-3'
[0028]ITS2-R(2B):5' -GCT CTT CCC GCT TCA CTC G-3'
[0029]PCR反应体系为30iiL，每个反应体系内含:50ng/iiL的模板DNAliiL，20mM Mg2+的 10Xbuffer2.L，5mM each dNTPl.0 ii L，5 ii M 的引物各 1.0 ii L，Taq 酶聚合酶 1U，加ddH20 至 30ii L。
[0030]反应前94°C预变性4min，接着为35个循环的反应，条件为94°C40s，52°C 30s，72°C 60s，最后 72°C延伸 7min。
[0031]3) PCR产物纯化与`克隆:
[0032]ITS2序列的PCR扩增产物经1.2%-1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，EB染色，以DL500标准DNA Marker为分子量标识，于凝胶成像系统下将PCR产物进行切胶并利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化回收(具体操作步骤参考纯化试剂盒说明书)。纯化产物送出进行双向测序列。无法直接测序的ITS2的PCR产物，经克隆并进行菌落PCR检验后再送出测序。
[0033]克隆:将纯化好的PCR产物片段连接入载体中T-easy VECTOR (Promega),体系IOu L:其中T4连接酶1U，2X快速连接buffer5ul，PCR产物L，T载体Iii L。16°C反应lh。将全部连接产物加入IOOul的JM109感受态细胞(Takara)进行转化。转化过的含感受态细胞的菌液均匀涂布于添加IPTG (100 u 110mmol/L溶液)和X-gal (100 U 12%溶液)的氨节青霉素LB平板上,37°C培养培养过夜(16h)。随机挑选白色单一菌落,接种于450 u L的LB培液中，37°C震荡培养到指数级生长或可见云雾状。取I y L培养液做菌落PCR，检测插入的片段，选2个阳性克隆送测序公司进行测序。
[0034]菌落PCR 反应条件:15ii L 的反应体系:Mg2+2.5mmol/L, dNTP0.25mmol/L,引物
0.25 u mol/L, Taq酶IU ;反应条件为94°C预变性5min，之后进行30循环:94°C变性45s，52°C退火 45s，72°C延伸 120s ;最后，72°C延伸 5min。
[0035]4)测序与序列数据分析
[0036]采用ABI3730测序仪进行纯化产物的双向测序，测序列引物为PCR扩增引物。测序结果用Om)maS231程序读取，人工校对每一个序列的每一个碱基与波形，以确保准确无误，并去除序列两端的引物序列等。DNA序列以Clustal XL 81软件(Thompson et al.,1997)比对，获得不同序列间的保守与变异碱基位点，通过特有变异位点鉴定不同产区的西施舌群体。(比对所形成的文件可于DnaSP4.10.9软件(Rozas et al., 2003)中分析样品序列保守、变异位点。可从GenBank数据库下载西施舌不同群体ITS2序列(GenBank序列登录号:DQ523265CL5，DQ523266CL7, DQ875817GX23，或 FJ827075-FJ827079 等)，作为参照序列进行特异位点比对与查找。)
[0037]5)结果分析
[0038]如果样品得到的序列比对结果中存在与图中一样的碱基插入/缺失或特异的位点，即为属于相应地理群体来源的样品。其中，检测样品的ITS2序列中若有与图中Hap6-Hapl0下划线处一样的碱基变异或插入/缺失位点(见箭头“f”)，则为CL群体产地样品；若样品序列存在与Hap-1-Hap5 —样的灰色部分碱基缺失(位点21及或有1_12缺失)，即为来自QD群体产地样品。
[0039]图1中，灰色有下划线处为西施舌CL群体与QD群体的序列特异鉴定位点。其中:Hap-1—Hap-5为QD群体，QD群体全在箭头所指的位点21有一个碱基缺失；Hap_6—Hap-1O为CL群体，即有在箭头所指处的在13、14-16、19及20特异位点有碱基转换，在17-18位点有2个碱基缺失，及21位有I个碱基“A”插入；另，箭头所指的1-12位点为CL群体内的特异位点。
[0040]对不同地理群体西施舌38个样品进行上述PCR扩增和比对，结果见图2。图2中: ”表示江苏山东群体和福建长乐群体的保守位卢，r表示鉴别来自江苏山东群体和福建
长乐群体(CL)的碱基位点，RZ, JM, QD和GY分别表示来自山东的即墨、日照，及江苏的启东、赣榆的西施舌个体序列(另外序列为从NCBI数据库下载作为比较)。经比对后去掉两端部分引物序列及没有变化部分序列，获取西施舌不同地理群体的序列长度在385~400bp之间，ITS2序列变异位点主要在靠近序列的3’端，序列间差异主要表现在碱基的插入/缺失，碱基相差有15bp，共有7处为鉴定群体的特异位点，分别为:位点1-12 (第208-219，为12个碱基插入/缺失)，位点13 (第226，T C转换)，位点14-16 (第273-275，TCT转换为CTC)，位点17-18 (第279-280，2个碱基插入/缺失)，位点19 (第317，T C转换)，位点20(第381，G A转换)，位点21 (第395，一个碱基插入/缺失)。ITS2序列变异位点较少，主要靠近ITS2的3’端，序列间差异主要表现在碱基的转换与插入/缺失，也证明该区域序列是相对保守的，体现了 ITS2序列作为西施舌群体鉴定标记的既简明又可靠的特性。
[0041]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
【权利要求】
1.一种rDNA ITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，包括: (1)采集不同群体的西施舌个体，取西施舌样品的闭壳肌组织，提取基因组总DNA，洗脱定溶于TE溶液或双蒸水中，_20°C保存，备用时于4°C保存； (2)以 ITS2-F:5 ' -GGGTCGATGAAGAACGCAG-3 ' 和ITS2-R:5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'为引物，进行 ITS2 序列的 PCR 扩增；然后 PCR扩增产物经1.2%-1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测完毕进行切胶并利用PCR产物纯化试剂盒纯化回收,纯化产物进行双向测序列,其中无法直接测序的PCR产物，经克隆并进行菌落PCR检验后再测序；应用软件进行不同序列比对，得出特异性位点，判断样品所属。
2.根据权利要求1所述的一种rDNAITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于:所述步骤(1)中的TE溶液浓度为IOOng/ u I。
3.根据权利要求1所述的一种rDNAITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的PCR扩增的反应体系为30 iiL，每个反应体系内含:50ng/iiL的模板 DNAl ii L，20mM Mg2+的 10Xbuffer2.5 y L，5mM each dNTPl.0 y L，5 y M 的引物各1.0u L, Taq 酶聚合酶 IU，加 ddH20 M 30 U L0
4.根据权利要求1所述的一种rDNAITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的PCR扩增反应具体为:反应前94°C预变性4min，接着为35个循环的反应，条件为 940C 40s, 520C 30s, 72°C 60s，最后 72°C延伸 7min。
5.根据权利要求1所述的一种rDNAITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于:所述步骤(2)中以DL500标准DNA Marker为分子量标识进行切胶。
6.根据权利要求1所述的一种rDNAITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的克隆具体为:将纯化好的PCR产物片段连接入载体中T-easyVECTOR，体系IOiiL:其中T4连接酶1U，2X快速连接buffer5 yl，PCR产物2 y L，T载体I u L ;16°C反应lh，将全部连接产物加入100 iil的JM109感受态细胞进行转化，转化过的含感受态细胞的菌液均匀涂布于添加IPTG和X-gal的氨苄青霉素LB平板上，37°C培养过夜；挑选白色单一菌落，接种于450 ii L的LB培养液中，37°C震荡培养到指数级生长或可见云雾状；取Iu L培养液做菌落PCR，检测插入的片段，选2个阳性克隆进行测序。
7.根据权利要求6所述的一种rDNAITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于:所述IPTG用量为lOOiil，浓度为10mmol/L ;X_gal用量为100 yl，浓度为2% ;培养过夜具体为培养16h。
8.根据权利要求1所述的一种rDNAITS2序列标记快速鉴定西施舌群体的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的菌落PCR反应条件为:15iiL的反应体系:Mg2+2.5mmol/L,dNTP0.25mmol/L，引物0.25 u mol/L, Taq酶IU ;反应条件为94°C预变性5min，之后进行30循环:94°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸120s ;最后，72°C延伸5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103497995SQ201310425234
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】陈淑吟, 吉红九, 陆勤勤, 张美如 申请人:江苏省海洋水产研究所