辣根过氧化物酶介导自由基引发体系及制备水凝胶的方法
【专利摘要】本发明涉及辣根过氧化物酶介导自由基引发体系及制备水凝胶的方法，引发体系由N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶和过氧化氢组成。采用N-羟基琥珀酰亚胺作为酶的底物，避免了使用生物毒性较大的乙酰丙酮。本发明制备方法通过调节三元引发体系的组分浓度比例，可以控制在室温下50s～5min内引发单体聚合制备水凝胶，并可用于制备高强度的纳米复合水凝胶，具有环境友好、成胶快速可控的优势，在药物控制释放、酶固定化、组织工程等领域具有明显的应用前景。
【专利说明】辣根过氧化物酶介导自由基引发体系及制备水凝胶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及高分子【技术领域】，尤其是涉及一种辣根过氧化物酶介导自由基引发体系及利用该体系制备水凝胶的方法。
【背景技术】
[0002]自由基聚合反应常用于高分子聚合物生产、精细化工品制造中，是工业生产高分子产品的重要技术。自由基反应的第一步都是自由基引发。传统的自由基引发方式主要有:热引发；氧化还原引发；紫外光引发；高能辐射(如激光、α射线、β射线、Υ射线、X射线辐照等)引发等。这些聚合引发方式或需要使用特殊设备并消耗大量能量，或需要使用某些有毒的引发剂，对生物体有害，而且可能影响自然环境，反应条件较为苛刻。
[0003]与传统的自由基引发方式相比较，通过生物酶催化反应产生自由基是一种环境友好、反应条件温和、高效、低能耗、操作简便的自由基引发方式，是用于自由基聚合反应制备高分子材料的优越方法。
[0004]氧化还原酶可以催化电子转移反应产生自由基，在水溶液中引发烯类单体的聚合。文献报道，辣根过氧化物酶(EC1.11.1.7) / β - 二酮/过氧化氢三元酶介导自由基引发体系能引发亲水性乙烯基单体(如丙烯酰胺)进行自由基聚合，或引发疏水性单体(如苯乙稀)进行细乳液聚合(Polym.Chem.,2012, 3,900-906 ；B1macromolecules, 2006, 7,2927-2930 ；Chem.Rev.，2001，101，3793-3818)。然而，该反应中会出现不可重现的、时间较长(45?360min)的诱导期，不利于实际应用。本课题组研究开发了一系列组分配比优化的辣根过氧化物酶/乙酰丙酮/过氧化氢三元引发体系并申请了中国专利。这类引发体系可以在室温下快速^min内)引发自由基聚合，制备得到具有高强度、高催化性能的纳米复合水凝胶(Chem.Commun.,2013,101，3793-3818)。在该体系中，以乙酰丙酮作为辣根过氧化物酶的底物，产生自由基引发聚合。然而，乙酰丙酮生物毒性较大，不利于其在生物材料中的应用。目前，不含乙酰丙酮的辣根过氧化物酶介导自由基聚合引发体系尚未见报道。
[0005]N-羟基琥珀酰亚胺是一种在生物学、合成化学中有广泛应用的酰胺类化合物，其结构中含有活泼的氮羟基，可与抗原、抗体、核酸等共价结合，常用于医药中间体，合成多肽、抗生素等的前体以及肿瘤的诊断显像和治疗，生物相容性好。本课题组最近研究发现，N-羟基琥珀酰亚胺与辣根过氧化物酶、过氧化氢按一定浓度比例配制，可产生自由基引发单体进行聚合反应。该自由基引发体系能用于快速可控地制备水凝胶，有利于所制备的水凝胶在生物体内的应用，如在动脉栓塞中作为栓塞剂，或作为可注射的组织工程支架材料坐寸。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种基于N-羟基琥珀酰亚胺的辣根过氧化物酶介导的自由基聚合引发体系。
[0007]本发明的另一个目的是采用上述引发体系在水溶液中引发烯类单体进行聚合制备水凝胶的方法，该方法反应条件温和，操作简便，成胶快速且时间可控，并可用于制备高强度的纳米复合水凝胶。
[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0009]辣根过氧化物酶介导自由基引发体系，该体系为在室温下以水为反应介质引发烯类单体进行自由基聚合的引发体系，包含N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶和过氧化氢。
[0010]过氧化氢和辣根过氧化物酶(300units/mg)的摩尔浓度比为25?960，同时满足N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为2?29，引发体系中采用的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度不低于2.65mM，过氧化氢的摩尔浓度不低于0.66mM。
[0011]本发明的引发体系制备工艺简单，可采用多种方式进行配制，可以将N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢三者混合后直接使用；或者先将N-羟基琥珀酰亚胺和辣根过氧化物酶混合反应一段时间后，再与过氧化氢配合使用；或者先将N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢混合反应一段时间后，再与辣根过氧化物酶配合使用。
[0012]区别于现有技术所述的引发体系产生由乙酰丙酮衍生的碳中心自由基引发聚合的机理，本发明的引发体系具有新型的自由基引发机理。通过电子自旋共振(ESR)证明了本发明的引发体系中产生了由N-羟基琥珀酰亚胺衍生的氮氧自由基。在无自旋捕捉剂的情况下，本发明的三元引发体系(其中N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为29，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为278)产生的ESR扫描信号为氮氧自由基的9重峰，说明体系中产生了由N-羟基琥珀酰亚胺衍生的氮氧自由基从而引发聚合反应进行。
[0013]利用辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，将N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶与烯类单体的水溶液混合均匀，然后向其中加入过氧化氢，调节辣根过氧化物酶/N-羟基琥珀酰亚胺/过氧化氢三元引发体系的组分浓度比例，在室温下控制在50s?5min内产生自由基引发单体聚合形成三维聚合物网络，得到水凝胶。
[0014]辣根过氧化物酶/N-羟基琥珀酰亚胺/过氧化氢三元引发体系的组分浓度调整为:过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为25?960，并同时满足N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为2?29，引发体系中采用的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度不低于2.65mM,过氧化氢的摩尔浓度不低于0.66mM。
[0015]所述的烯类单体选自水溶性的丙烯酸酯衍生物、丙烯酰胺衍生物或N-乙烯基吡咯烷酮中的至少一种；烯类单体的加入量占反应原料总重量的5?15%，优选8?10%。
[0016]所述的水溶性的丙烯酸酯衍生物为甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、丙烯酸羟丙酯(HPA)或聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(PEGMA)，所述的丙烯酰胺衍生物为丙烯酰胺(AM)、N, N- 二甲基丙烯酰胺(DMAA)或N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)。
[0017]反应物中还可以添加带有两个或者多个双键的水溶性化合物作为交联剂，包括N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)或乙烯基修饰的蛋白质，所述的交联剂用量占反应原料总重量的0.3?5%。
[0018]反应物中还可以添加可水分散的无机纳米材料制备高强度的纳米复合水凝胶，所述的无机纳米材料为纳米二氧化娃或纳米轻基磷灰石，优选平均粒径10?40nm的纳米二氧化硅。所述的无机纳米材料的用量占反应原料总重量的5?16%。
[0019]普通高分子水凝胶一般只能抵抗大约20?10kPa的压缩强度而且易被压碎。本发明制备的纳米复合水凝胶能抵抗1300kPa左右的压缩强度而且能恢复到原状，具有优良的力学性能和生物相容性，可以应用于药物控制释放、酶固定化、组织工程等领域。
[0020]与现有技术相比，本发明的突出优点是:采用生物相容性好的N-羟基琥珀酰亚胺作为酶的底物，提供了一种新型的辣根过氧化物酶介导的自由基引发机理，避免了使用生物毒性较大的乙酰丙酮，有利于其在生物材料中的应用。本发明的另一突出优点是:通过调节辣根过氧化物酶/N-羟基琥珀酰亚胺/过氧化氢三元引发体系的组分浓度比例，能在室温下使用较低的引发剂浓度(例如，N-羟基琥珀酰亚胺摩尔浓度为2.65mM,同时过氧化氢的摩尔浓度为0.66mM)快速可控地制备水凝胶。因而该方法在制备可注射水凝胶应用于生物学领域具有明显的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为电子自旋共振检测到的本发明自由基引发体系产生的自由基信号。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案，以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
[0023]实施例1
[0024]1)配制前驱液:取N，N_ 二甲基丙烯酰胺0.11?0.13g，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07?0.09g，去离子水1.6?1.7g加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀。
[0025]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(λ 66mg,辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L (反应体系中Ν-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为4.35，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为25，过氧化氢最终摩尔浓度为0.66mM)，快速混匀同时用秒表计时，密闭静置得到浅棕红色透明水凝胶，成胶时间3minl0so
[0026]实施例2
[0027]1)配制前驱液:步骤同实施例1。
[0028]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺0.61mg，辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L (反应体系中Ν-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为2，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为25，过氧化氢最终摩尔浓度为1.32mM)，快速混匀，密闭静置得到浅棕红色透明水凝胶，成胶时间2min20s。
[0029]实施例3
[0030]1)配制前驱液:步骤同实施例1。
[0031]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺1.77mg，辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L (反应体系中Ν-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为5.84，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为25，过氧化氢最终摩尔浓度为1.32mM)，快速混匀，密闭静置得到浅棕红色透明水凝胶，成胶时间lmin40s。
[0032]实施例4
[0033]1)配制前驱液:步骤同实施例1。
[0034]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺8.02mg，辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L (反应体系中N-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为13.23，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为50，过氧化氢最终摩尔浓度为2.63mM)，快速混匀，密闭静置得到浅棕红色透明水凝胶，成胶时间50s。
[0035]实施例5
[0036]I)配制前驱液:取N，N-二甲基丙烯酰胺0.09?0.llg，交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.05?0.07g，去离子水1.62?1.72g加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均匀。
[0037]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺8.5mg,辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L(反应体系中N-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为5.84，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为480，过氧化氢最终摩尔浓度为6.32mM)，快速混匀，密闭静置得到浅黄色透明水凝胶，成胶时间2min30s。
[0038]实施例6
[0039]I)配制前驱液:步骤同实施例5。
[0040]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺8.5mg,辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L(反应体系中N-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为5.84，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为960，过氧化氢最终摩尔浓度为6.32mM)，快速混匀，密闭静置得到浅黄色透明水凝胶，成胶时间3min40s。
[0041]实施例7
[0042]I)配制前驱液:步骤同实施例5。
[0043]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺5.34mg，辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L (反应体系中N-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为3.67，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为480，过氧化氢最终摩尔浓度为6.32mM)，快速混匀，密闭静置得到浅黄色透明水凝胶，成胶时间5min。
[0044]实施例8
[0045]I)配制前驱液:步骤同实施例5。
[0046]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺7.04mg,辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L (反应体系中N-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为4.84，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为480，过氧化氢最终摩尔浓度为6.32mM)，快速混匀，密闭静置得到浅黄色透明水凝胶，成胶时间3min。
[0047]实施例9
[0048]I)配制前驱液:步骤同实施例5。
[0049]2)水凝胶的制备:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺42.17mg,辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L,过氧化氢水溶液50 μ L(反应体系中N-轻基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为29，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为480，过氧化氢最终摩尔浓度为6.32mM)，快速混匀，密闭静置得到浅黄色透明水凝胶，成胶时间2min25s。
[0050]实施例10
[0051]I)配制前驱液:取N，N- 二甲基丙烯酰胺0.30g,纳米二氧化硅水分散液(21wt% ) 1.533g，聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)6.77mg加入样品瓶中，用旋涡混合器混合均勻。
[0052]2)水凝胶的制备及性能测试:在上述前驱液中依次加入N-羟基琥珀酰亚胺10.33mg,辣根过氧化物酶浓缩液100 μ L，过氧化氢水溶液50 μ L(反应体系中N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为7.1，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为480)，快速混匀，密闭静置得到浅黄色透明水凝胶(含16wt%纳米二氧化硅)。上述水凝胶制成圆柱状样品(直径15.7mm，高9.0mm)后，使用电子万能试验机测得压缩强度为1350kPa (压缩应变99% )，测试后可恢复原状。
[0053]如图1所示，在无自旋捕捉剂的情况下，本发明的三元引发体系(其中N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为29，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为278)产生的ESR扫描信号为氮氧自由基的9重峰，说明体系中产生了由N-羟基琥珀酰亚胺衍生的氮氧自由基从而引发聚合反应进行。
[0054]实施例11
[0055]利用辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，该方法将N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶与烯类单体的水溶液混合均匀，然后向其中加入过氧化氢，调节辣根过氧化物酶/N-羟基琥珀酰亚胺/过氧化氢三元弓I发体系的组分浓度比例，其中，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为25，N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为4，引发体系中采用的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度为2.65mM，过氧化氢的摩尔浓度为0.66禮，采用的烯类单体为聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，加入量占反应原料总重量的5%，另外，在水凝胶的制备过程中还可以加入N，N-亚甲基双丙烯酰胺，交联剂用量占反应原料总重量的0.3%。
[0056]在室温下控制在4minl0s内产生自由基引发单体聚合形成三维聚合物网络，得到水凝胶。
[0057]实施例12
[0058]利用辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，该方法将N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶与烯类单体的水溶液混合均匀，然后向其中加入过氧化氢，调节辣根过氧化物酶/N-羟基琥珀酰亚胺/过氧化氢三元引发体系的组分浓度比例，过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为960，并且N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为29，引发体系中采用的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度不低于19.1mM,过氧化氢的摩尔浓度不低于0.66mM。选用的烯类单体为N，N-二甲基丙烯酰胺，加入量占反应原料总重量的15%，另外，在水凝胶的制备过程中还可以加入平均粒径为10?40nm纳米二氧化硅制备高强度的纳米复合水凝胶，用量占反应原料总重量的16%。在室温下控制在5min内产生自由基引发单体聚合形成三维聚合物网络，得到水凝胶。
[0059]以上对本发明做了示例性的描述，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其他的任何未背离本发明的原理实质下所作的修改、替换、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.辣根过氧化物酶介导自由基引发体系，其特征在于，该自由基引发体系为在室温下以水为反应介质引发烯类单体进行自由基聚合的引发体系，包含N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶和过氧化氢，所述的过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为25?960，所述的N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为2?29。
2.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系，其特征在于，所述的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度不低于2.65mM,过氧化氢的摩尔浓度不低于0.66mM。
3.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系，其特征在于，所述的自由基引发体系为N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢直接混合得到自由基聚合的引发体系； 或是将N-羟基琥珀酰亚胺和辣根过氧化物酶混合后，再加入过氧化氢配合使用得到自由基聚合的引发体系； 或是将N-羟基琥珀酰亚胺和或过氧化氢混合后，再加入辣根过氧化物酶配合使用得到自由基聚合的引发体系。
4.利用权利要求1-3中任一项所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，其特征在于，该方法将N-羟基琥珀酰亚胺、辣根过氧化物酶与烯类单体的水溶液混合均匀，然后向其中加入过氧化氢，调节辣根过氧化物酶/N-羟基琥珀酰亚胺/过氧化氢三元弓I发体系的组分浓度比例，在室温下控制在50s?5min内产生自由基引发单体聚合形成三维聚合物网络，得到水凝胶。
5.根据权利要求4所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，其特征在于，所述的过氧化氢和辣根过氧化物酶的摩尔浓度比为25?960，并且N-羟基琥珀酰亚胺和过氧化氢的摩尔浓度比为2?29，引发体系中采用的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度不低于2.65mM,过氧化氢的摩尔浓度不低于0.66mM。
6.根据权利要求4所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，其特征在于，所述的烯类单体选自水溶性的丙烯酸酯衍生物、丙烯酰胺衍生物或N-乙烯基吡咯烷酮中的至少一种:烯类单体的加入量占反应原料总重量的5?15%，优选8?10%。
7.根据权利要求6所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，其特征在于，所述的水溶性的丙烯酸酯衍生物为甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯或聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯；所述的丙烯酰胺衍生物为丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺或N-异丙基丙烯酰胺。
8.根据权利要求4所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，其特征在于，在水凝胶的制备过程中还可以加入带有两个或者多个双键的水溶性化合物作为交联剂，包括N，N-亚甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯或乙烯基修饰的蛋白质；所述的交联剂用量占反应原料总重量的0.3?5%。
9.根据权利要求4所述的辣根过氧化物酶介导自由基引发体系制备水凝胶的方法，其特征在于，在水凝胶的制备过程中还可以加入可水分散的无机纳米材料制备高强度的纳米复合水凝胶，所述的无机纳米材料为纳米二氧化硅或纳米羟基磷灰石，优选平均粒径为10?40nm的纳米二氧化硅；所述的无机纳米材料的用量占反应原料总重量的5?16%。
【文档编号】C12P13/02GK104450814SQ201310425096
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】苏腾, 王启刚 申请人:同济大学