检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的引物、探针及方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的实时荧光定量PCR引物和探针以及使用其进行检测的方法，引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ?ID?No.2，SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示。本发明还提供了检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。
【专利说明】检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的引物、探针及方法和试剂
合
Sl
【技术领域】
[0001]本发明属微生物检测领域，涉及检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的引物、探针及方法和试剂盒
【背景技术】
[0002]大肠埃希氏菌是人类肠道中正常菌群的一部分，但某些血清型的菌株能引起尿道感染、菌血症、脑膜炎和腹泻等临床症状，这些通常是由五种致泻性大肠埃希氏菌引起，包括产志贺毒素大肠埃希氏菌(STEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)和肠集聚性大肠埃希氏菌(EAEC)。其中，EPEC和EAEC均为黏附性大肠埃希氏菌(AEC)，EPEC是定位粘附(LA)模式，EAEC是集聚性粘附(AA)模式。最新研究发现一种新的粘附性大肠埃希氏菌，在体外表现出对HEP-2细胞弥散性粘附的特征，这与以前两种AEC有着显著的差别，称之为“弥散粘附性大肠埃希氏菌(DAEC)”。
[0003]研究表明，DAEC主要感染1-5岁儿童，引起水样腹泻，但不引起婴儿腹泻，这与其他致泻性大肠埃希氏菌也有显著的不同。通过血清学分析，发现DAEC主要集中在0:86，0:127, 0:142, 0:158四个血清型，这与EPEC经常出现的血清型有部分交叉(Diffuselyadherent Escherichia coli strains isolated from children and adults constitutetwo different populations, BMC M`icrobiology2013, 13:22)0
[0004]DAEC检测最经典和准确的方法是体外培养，观察待检DAEC菌株对HEp_2细胞的致病变特征来判定其致病性，一般典型的特征是出现弥散性粘附(DA)，不同于定位粘附和聚集性粘附。此方法虽然准确，但是操作繁琐，不适合开展大规模样品的筛查，也不能满足应急检测的需求。血清学鉴定和分类只能提供传统意义上基于O抗原对大肠埃希氏菌的分型，无法解决致泻型的区分。
[0005]随后发展起来的DNA探针技术，从分子水平上探讨DAEC的毒力因子，筛选出afa基因家族和AID1-1可能是导致DAEC弥散性粘附的特征性毒力因子，主要使用daaC探针和AID1-1 探针(Molecular Characterization of a Fimbrial Adhesin, F1845, MediatingDiffuse Adherence of Diarrhea-Associated Escherichia coli to HEp_2CeIIs, JOURNALOF BACTERIOLOGY,Aug.1989, p.4281-4289;Cloning and Express ion of anAdhesin(AIDA-1) Involved in Diffuse Adherence of Enteropathogenic Escherichiacoli, INFECTION AND IMMUNITY, Mayl989, p.1506-1511)，其中 daaC 探针是 afa基因家族的重要成员，在弥散性粘附因子表达方面起到重要的作用，daaC探针检测与HEp-2细胞病变鉴定的一致率超过75% ;而AID1-1探针作为分子检测标志，研究表明与HEp-2细胞病变鉴定的一致率仅有2%。此方法涉及到基因组提取技术、基因重组技术、克隆构建与筛选技术、分子杂交技术等，步骤相当繁琐和复杂，也不适用于大规模样品的筛查。
[0006]普通PCR技术出现后，普通PCR检测DAEC的方法在操作步骤和操作时间上都大为缩短，检测灵敏度也有所提高，适合进行中大量样品的快速筛查，但是普通PCR技术需要打开PCR管进行产物分析，这增加了 PCR产物污染的可能性，容易出现假阳性结果，另外，普通PCR技术的灵敏度还不够高，对DAEC菌量低的样品可能无法检测，造成假阴性结果。
[0007]在DNA探针技术的基础上，普通PCR技术应用到DAEC的分子检测中去，还有另外一种PCR技术——多重PCR技术，能够在一个反应中同时鉴定六种致泻性大肠埃希氏菌，包括DAEC的鉴定。这些PCR技术在检测DAEC时多采用afa家族基因(EnterotoxigenicEscherichia coli and Diffusely Adherent E coli as Likely Causes of a Proportionof Pathogen-Negative Travelers’ Diarrhea—A PCR-Based Study, Journal of TravelMedicine，Volumel5，Issue6，2008，412 - 418;Single Multiplex PCR Assay To IdentifySimultaneously the Six Categories of Diarrheagenic Escherichia coli Associatedwith Enteric Infections，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，Oct.2005，p.5362 - 536
5)。但此种方法最大的问题是因扩增目标基因增多牺牲了检测灵敏度，所以普通多重PCR方法只适合于菌株的鉴定而不是快速筛查。
【发明内容】
[0008]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的特异性引物和探针序列，并在这套序列的基础上建立一种基于实时荧光PCR的特异敏感的快速检测方法，提供一个弥散粘附性大肠埃希氏菌(DAEC)快速检测试剂盒。
[0009]为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物和探针的技术方案:
[0010]1、选择检测DAEC的目标基因
[0011 ] 根据以往的研究数据，afa基因家族是DAEC致病性的分子基础，afa基因家族包括daaA、daaB、daaC、daaD、daaE、daaF等成员，其中daaC和daaE是DAEC的检测用目标基因。本发明将选择daaC基因用于DAEC检测的目标基因。
[0012]2、设计检测DAEC的引物和探针
[0013]本发明主要是通过检测DAEC的毒力基因daaC达到筛检DAEC的目的。
[0014]在Genbank中查找daaC基因的全长序列，把所有daaC基因全长序列导入Mega4软件中，比对分析获得daaC基因的保守序列区段。把保守序列区段输入primer express3软件中，设计3-5套引物探针备用方案。引物和探针设计时要考虑到Tm值、GC含量，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况。
[0015]3、对daaC基因的引物探针备用方案进行Blast分析
[0016]在Genbank中对所有引物探针备用方案进行BLAST分析，获得特异性好的引物探针备用方案作为实验验证用方案。
[0017]4、对每一个可用实验验证方案进行PCR验证，确定引物探针的可用性，包括特异性评估和敏感性评估。
[0018]基于上述技术方案，本发明提供了一种用于检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的特异性引物，其核苷酸序列为:
[0019]上游引物:GGCCACGGAGAGTTATCAGTTT，
[0020]下游引物:AGCAGAAAAGCCGGAATGC。
[0021]进一步地，本发明还提供与所属引物配合使用的荧光探针。其中探针的5’标记荧光基因FAM，3’标记淬灭基因BHQ1。
[0022]探针序列为:Fam-TATCCCTCAGGTGGCACTGCGTCC-BHQ1。
[0023]本发明还提供了一种检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的实时荧光PCR检测方法。该方法通过检测弥散粘附性大肠埃希氏菌致病特征性afa基因家族基因片段，能够快速的筛查这种新型的粘附性大肠埃希氏菌——弥散粘附性大肠埃希氏菌，其实现的技术方案如下:
[0024]1、引物探针合成
[0025]在基因合成公司合成所有的寡聚核苷酸序列。
[0026]2、DNA模板准备
[0027]PCR扩增弥散粘附性大肠埃希氏菌afa基因家族中daaC基因序列(GenBank: JN688153.1)保守序列840bp，并将其连接到pRB322质粒上，命名为pRB322-daaC，作为方法建立的模板。
[0028]3、构建和优化实时荧光PCR检测体系
[0029]在确定PCR反应体系中引物探针序列后，还需要从引物探针浓度、退火温度、反应体系配置、反应条件等方面分别进行优化。反应体系的配置如下:
[0030]Hotstar DNA 聚合酶 1-2U，5XPCR buffer (Tris-HCl IOOmM (PH8.3), KC1250mM,Tween-200.2%) 5 μ L, IOmM dNTP0.5 -1.5 μ L，25mM MgCl22 -5 μ L，引物探针混合物1.25 μ L，DNA模板2 μ L，超纯水补至25 μ L。
[0031]引物探针混合物的浓度配比见表I。
[0032]表I引物探针混合物成分配比表
[0033]
【权利要求】
1.一种用于检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的特异性引物，其核苷酸序列为: 上游弓 I 物:GGCCACGGAGAGTTATCAGTTT， 下游引物:AGCAGAAAAGCCGGAATGC。
2.与权利要求1所述引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列为: Fam-TATCCCTCAGGTGGCACTGCGTCC-BHQI。
3.一种弥散粘附性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
4.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:阳性对照，DNA聚合酶，反应体系缓冲液，Mg2+，dNTP和超纯水。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作反应体系为=HotstarDNA聚合酶 1-2U，5XPCR buffer (Tris-HClIOOmM(PH8.3), KC1250mM, Tween-200.2%) 5 μ L, IOmMdNTP0.5-1.5 μ L，25mM MgCl22-5 μ L，引物探针混合物1.25 μ L，DNA模板2 μ L，超纯水补至25 μ L0
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为: 95°C预变性lOmin，I个循环；95°C变`性30s，55_62°C退火延伸30-60s，40个循环；4°C保持。
【文档编号】C12Q1/68GK103451305SQ201310424938
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】王雷, 莫莎, 王晓艳, 张志强 申请人:北京卓诚惠生生物科技有限公司