大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法
【专利摘要】本发明涉及大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L?色氨酸的方法，包括以下步骤：（1）、培养成熟的大肠埃希氏菌JLTrp菌种；（2）、发酵罐培养：将成熟菌种接种至发酵罐内，在培养温度35?37℃，pH采用补充液氨分段控制，压力0.082?0.085MPa，风量0.3VVM?2.3VVM，培养过程通过不断添加发酵培养基控制培养基中葡萄糖的质量浓度为0.01?0.5%的条件下培养制取L?色氨酸；本发明方法采用大肠埃希氏菌JLTrp作为菌种，在生产过程中不需要添加抗生素的即可生产L?色氨酸，产品中无抗生素残留，且发酵周期缩短，产L?色氨酸水平提高到70?80g/L。CGMCC No. 7.21720160508
【专利说明】
大肠埃希氏菌儿Trp发酵生产L-色氨酸的方法
技术领域
[0001] 本发明设及微生物发酵技术领域，具体设及一种大肠埃希氏菌化化P发酵生产心 色氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 色氨酸又名Q-氨基-e-吗I噪丙酸，它有D-型和k型两种异构体，天然存在的只有k 色氨酸。L-色氨酸是含有吗I噪基的中性芳香族氨基酸，学名：e-吗I噪基丙氨酸；英文名 T巧Ptophan，分子式Cii出2化化，相对分子量204.21，烙点289 °C。k色氨酸为白色或微黄色结 晶或结晶性粉体，无臭味微苦。在水中微溶，在乙醇中极微溶解。它广泛存在于天然蛋白质 中。1^-色氨酸对人体和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，被广泛用于医药和食品、 饲料等领域。近年来，随着色氨酸在医药、食品和饲料等方面的应用，其市场需求量在不断 增加。
[0003] k色氨酸的生产方法包括化学合成法、蛋白质水解法、酶促转化法和发酵法。由于 化学合成法和蛋白质水解法需要大量的有机溶剂，存在原料来源和环境污染等问题，在生 产中极少使用。酶促转化法成本较高，污染量大。随着k色氨酸市场需求激增，越来越多的 研究者和科研机构开始对k色氨酸发酵进行全面的研究。然而，随着粮食价格的普遍上涨 和国家对用粮食作物用于规模生产进行调控，使之成为影响心色氨酸发酵的主要因素，因 此寻求粮食替代品，从而降低生产成本成为新的研究目标。现有技术中，用于生产k色氨酸 的菌种通常仅对一种或两种抗生素(如四环素)具有抗性，菌种筛选过程中也仅经过一种或 两种抗生素筛选。筛选得到的菌种遗传标记数量(即抗生素抗性基因数量)少，遗传不稳定。 在菌种扩大培养和发酵培养过程中容易发生变异，从而导致代谢途径发生改变，产生并非 我们所期望的代谢产物。为了防止菌种变异导致的糖酸转化率降低，在生产过程中一般需 要添加抗生素使培养过程中的菌保持该抗生素抗性基因，即保持菌种的稳定。
[0004] 抗生素的添加会导致所生产的心色氨酸中有抗生素残留；具有抗生素残留的k 色氨酸应用于饲料会残留在家禽家畜体内，食用家禽家畜会对消费者造成一定的危害;应 用于医药工业对药物也会有一定影响。
[0005] 目前的菌种对工艺条件要求较高，致使菌种在传代培养或发酵条件受限时，菌种 也会发生变异;具体说由于对原料、通风量及工艺要求较高，在生产过程中由于菌种遗传性 不稳定，致使产心色氨酸不稳定，水平仅为2.0-2.5%，转化率偏低仅为12-15%，同时原料及 能耗较大，导致生产成本偏高，面对市场盈利空间小。
【发明内容】
[0006]
【申请人】针对目前发酵方法中的不足，提出大肠埃希氏菌化化P发酵生产レ色氨酸 的方法，该方法在生产过程中不需要添加抗生素的即可生产k色氨酸，产品中无抗生素残 留，且产k色氨酸水平提高到70-80g/L。
[0007] 所述大肠埃希氏菌化T巧发酵生产k色氨酸的方法，包括W下步骤： (1) 、种子培养:采用不添加抗生素的液体种子培养基对菌种进行扩大培养，得到培养 成熟的种子液； 所述菌种为大肠埃希氏菌化化P，其对青霉素、苯挫西林、万古霉素、克拉霉素、阿奇霉 素、红霉素、克林霉素和利福平具有抗性，分类命名为大肠埃希氏菌(i?scAericAia ; 化Trp，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(CGMCC)，菌种保藏编号 为CGMCC NO. 7.217,保藏日期为2016年5月8号； 所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为:葡萄糖1.5-5.8%、酵母粉0.06- 0.28%、（畑4)2册〇4 0.82-0.92%、KC1 0.055-0.28%、MgS〇4 0.075-0.42%、（NH4)2S04 0.06- 0.24%、巧樣酸0.08-0.42%、FeS〇4 0.00014-0.00042%、MnS〇4 0.000065-0.00032%、维生素 BI 0.000065-0.00039%和生物素0.000013-0.000135%，其余为水； (2) 、发酵培养:将培养成熟的种子液接种到不添加抗生素的液体发酵培养基中进行发 酵培养得到发酵液，从发酵液中提取得到心色氨酸;发酵培养的条件为培养溫度35-37°C， pH采用补充液氨分段控制，0-1化7.0-7.2，1她-放罐时6.5-6.7，溶氧分段控制，0-1化12- 24%，1她-放罐时15-40%，压力0.082-0.085MPa，风量0.3VVM-2.3VVM，培养过程通过不断添 加发酵培养基控制培养基中葡萄糖的质量浓度为0.01-0.5%; 所述液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.3%、酵母粉0.16%、 (畑4)2册〇4 0.15-0.7%、KCL 0.13-0.7%、MgS〇4 0.06-0.45%、（NH4)2S04 0.09-0.43%、巧樣酸 0.05-0.5%、FeS〇4 0.0015-0.098%、化2S〇4 0.00051-0.0059%、MnS〇4 0.00015-0.0009〇/〇、 CuS〇4 0.00002-0.00018%、C〇C12 0.00014-0.00135%和aiS〇4 0.00019-0.0020%，其余为水。
[0008] 步骤(1)中所述种子培养，先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液 体种子培养基后再进行实罐灭菌;实罐灭菌结束后降溫冷却；制备接种用菌液，然后进行接 种，在W下条件下进行培养后得到培养成熟的种子液:培养溫度35°C，pH6.9-7.1，溶氧> 25〇/〇,压力 0.035-0.078MPa，风量 0.35VVM-1.8VVM。
[0009] 所述步骤(1)中接种的具体操作为:调节液体种子培养基pH值为6.9,溫度为35°C; 在压力0.06MPa，火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节 压力至0.03 M化，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口 上。
[0010] 所述步骤(1)中接种用菌液的制备方法为:取瓶内菌种生长饱满的茄型瓶，在火焰 保护下向茄型瓶内注入生理盐水55ml，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐 水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
[0011] 步骤(2)中所述发酵培养，先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培 养基后再进行实罐灭菌;实罐灭菌结束后降溫冷却，然后将步骤(1)得到的培养成熟的种子 液接种至发酵罐内进行培养得到发酵液。
[0012] 所述空罐灭菌的具体操作为:罐体清洗干净，检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐 灭菌，灭菌压力为0.13-0.14]\化1，溫度124-130°(：，时间为40-55111111。
[0013] 所述实罐灭菌的具体操作为:将种子培养罐或发酵罐的列管升溫至82°C后，开蒸 汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.125-0.131?曰，溫度124-125°(：，时间为15- 25min〇
[0014] 所述步骤(2)中接种的具体操作为:将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内。
[001引有益效果 一、本发明中采用大肠埃希氏菌化T巧作为菌种;该菌株具有独特的生理和生化特性， 经K-B法实验检测对30种抗生素的敏感性，对测试的2巧巾抗生素表现为敏感或中度敏感，对 青霉素、苯挫西林、万古霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、四环素和利福平具有 抗性，证明该菌株带有多种抗生素抗性基因；多种抗生素抗性基因均可作为遗传标记，能保 持其稳定的遗传特征，使菌种稳定性大大提高，在不添加抗生素的情况下即可在传几十代 甚至更多，更适合工业生产;将其应用于生产心色氨酸，稳定性高，不需要添加抗生素，即可 保持菌种的稳定性，所生产的心色氨酸中不包含抗生素，有效解决了当前同类菌种为保持 菌种稳定性生产过程中添加抗生素而导致k色氨酸产品中有四环素等抗生素残留的问题， 技术上具有巨大的进步。
[0016] 二、本发明根据大肠埃希氏菌化Trp的特性进行发酵，在本发明中的工艺和培养基 等条件的协同作用下，且发酵过程中对残糖浓度进行控制、溫度控制、pH与溶解氧分段控 审IJ，使发酵周期缩短，发酵产量提高，工艺简单易控制，成本较低，非常适合大规模工业应 用，并且，通过抑与溶解氧分段控制，人为的区分了菌体生长期及产心色氨酸期，使得菌体 在各生长期生长健壮，为后续产k色氨酸提供了保障。此外从培养基成分及培养条件出发， 生产心色氨酸的发酵培养基中，采用憐酸氨二锭和氯化钟进行替代现有技术中的憐酸二氨 钟，成本降低，且所采用的憐酸氨二锭和氯化钟的比例更适合于心色氨酸的生产工艺，发酵 培养基中的憐和钟恰好消耗完全，缓解了因憐过量而导致的憐酸戊糖途径受到抑制造成色 氨酸的合成因缺乏前体4-憐酸赤薛糖而受到抑制，与此同时通过钟离子增强酶活性提高效 率，解除由终产物色氨酸引起的对色氨酸生物合成途径酶的反馈抑制，增加色氨酸操纵子 的拷贝数W增强色氨酸生物合成酶的表达，从而达到高效生产k色氨酸的目的，该配方的 使用进一步减少了由于用于工业生产的憐酸二氨钟的纯度不高而带来的发酵液中灰分的 含量，简化了生产工艺，提高了产品质量。由此，本发明在相关工艺和培养等条件的相互协 调作用下，从而使生产k色氨酸的发酵周期由原来的50小时缩短至30-35小时，产k色氨 酸_水平由20-25g/L提高到70-80g/L，糖酸转化率由12-15%提高到25-32%，效果十分显著， 生产稳定;在工业生产中取得了较大的进步，具有较好的应用前景。
[0017] 生物材料的保藏 大肠埃希氏菌化化9，其分类命名为大肠埃希氏菌(63证61'；[。111曰（301；[)，保藏日期为 2016年5月8号，保藏单位及其简称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏编号为CGMCC No. 7.217。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明： 实施例1 大肠埃希氏菌化T巧发酵生产k色氨酸的方法，包括W下步骤： (1)、培养成熟的菌种 菌液的制备:取已经菌种生长饱满的茄型瓶，将生理盐水55ml在火焰保护下注入，并用 接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无菌操 作下转移到接种瓶内。
[0019] 所述菌种为
【申请人】在天津科技大学、中国氨基酸技术服务中屯、的指导下，将大肠 杆菌Escherichia Coli K-12 W3110变种经过诱变筛选等复杂工艺，筛选得到的对多种抗 生素具有抗性的大肠埃希氏菌化化P，其对青霉素、苯挫西林、万古霉素、克拉霉素、阿奇霉 素、红霉素、克林霉素和利福平具有抗性，分类命名为大肠埃希氏菌(i?scAericAia a 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC NO. 7.217,保藏日期为2016年5月8号。
[0020] 成熟的种子的培养： a、 空罐灭菌:种子培养罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌， 灭菌压力为〇.12MPa，溫度12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体种子培养基用累累入种子培养罐中，将种子培养罐的列管升溫至 80°C后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，溫度12TC，时间为 15min； C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:采用压差法进行接种，调P册.9，溫度35°C，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口 防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa，此时种液在压差 下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火 焰灼烧约Imin; e、 培养：培养溫度35 °C，通过补充液氨自动控制6.9-7.1，溶氧>25%，压力0.035- 0.078MPa，风量 0.35VVM-1.8VVM。
[0021] 使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基的各成分及其质量百分比含量 为：葡萄糖4%、酵母粉0.1%、（畑4)2册〇4〇.85%、1((：10.08%、]\%5〇4〇.16%、（畑4)28〇4〇.12%、巧 樣酸0.16%JeS〇4 0.00028%、MnS〇4 0.00012%、维生素 Bl 0.00013%、生物素0.00003%，其余 为水。
[0022] (2)、发酵罐培养 a、 空罐灭菌:发酵罐罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭 菌压力为〇.12MPa，溫度12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体发酵培养基用累累入种子培养罐中，将发酵罐的列管升溫至8(TC 后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为〇.12MPa，溫度12rC，时间为15min; C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内； e、 培养:发酵培养的条件为培养溫度35-37°C，pH采用补充液氨分段控制，0-1化7.0- 7.2，1她-放罐时6.5-6.7，溶氧分段控制，0-1化12-24%，1她-放罐时15-40%，压力0.082- 0.085MPa，风量0.3VVM-2.3VVM，培养过程通过不断添加发酵培养基控制培养基中葡萄糖的 质量浓度为0.01-0.5%; 使用的培养基为液体发酵培养基，各成分及其质量百分比含量为:葡萄糖1.3%、酵母粉 0.16%、（畑4)2册04 0.15%、KCL 0.13%、MgS04 0.06%、（NH4)2S04 0.09%、巧樣酸0.05〇/〇、 化504 0.0015%、化2504 0.00051%、]?11504 0.00015%、加504 0.00002%、(：〇(：12 0.00014%和 化504 0.00019%，其余为水。
[0023] 该实施例中发酵周期为30h，心色氨酸的产量为80g/L，糖酸转化率为32%; 其中k色氨酸的产量的计算方法为:k色氨酸产量g/L=k色氨酸质量/发酵液体积;糖 酸转化率的计算方法为:糖酸转化率%=(发酵液体积L礼-色氨酸产量g/L)/发酵耗葡萄糖总 质量 g* 100%。
[0024] 实施例2 大肠埃希氏菌化T巧发酵生产k色氨酸的方法，包括W下步骤： (1)、培养成熟的菌种 菌液的制备:取瓶内大肠埃希氏菌化化P生长饱满的茄型瓶，将生理盐水55ml在火焰保 护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生 理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
[0025] 成熟的种子的培养： a、 空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力 为0.12MPa，溫度 12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体种子培养基充分溶解后用累累入种子培养罐中，开列管升溫至80 °(：后，开蒸汽进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，溫度12rC，时间为15min; C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:采用压差法进行接种，调P册.9，溫度35°C，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口 防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa，此时种液在压差 下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火 焰灼烧约Imin; e、 培养：培养溫度35 °C，通过补充液氨自动控制6.9-7.1，溶氧>25%，压力0.035- 0.078MPa，风量 0.35VVM-1.8VVM。
[0026] 使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基各成分及其质量百分比含量 为： 葡萄糖 1.5%、酵母粉 0.06%、（畑4)2册〇4 0.82%、KC1 0.055%、MgS〇4 0.075%、（NH4)2S04 0.06%、巧樣酸0.08%、FeS〇4 0.00014%、MnS〇4 0.000065%、维生素 BI 0.000065%和生物素 0.000013%，其余为水。
[0027] (2)、发酵罐培养 a、 空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力 为0.12MPa，溫度 12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体种子培养基用累累入种子培养罐中，开列管升溫至8(TC后，开蒸汽 进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，溫度12rC，时间为15min; C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内； e、 培养:发酵培养的条件为培养溫度35-37°C，pH采用补充液氨分段控制，0-1化7.0- 7.2，1她-放罐时6.5-6.7，溶氧分段控制，0-1化12-24%，1她-放罐时15-40%，压力0.082- 0.085MPa，风量0.3VVM-2.3VVM，培养过程通过不断添加发酵培养基控制培养基中葡萄糖的 质量浓度为0.01-0.5%; 使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基各成份的质量百分比含量为:葡萄 糖 1.3%、酵母粉0.16%、（畑4)2册〇4 0.7%、KCL 0.7%、MgS〇4 0.45%、（NH4)2S04 0.43%、巧樣酸 0.5%、FeS04 0.098%、化2S04 0.0059%、MnS04 0.0009%、CuS04 0.000 1 8%、CoCl2 0.00135%和 ZnS〇4 0.0020%，其余为水。
[00%]该实施例中发酵周期为35h，心色氨酸的产量为70g/L，糖酸转化率为27%;其中k 色氨酸的产量的计算方法为:心色氨酸产量g/LA-色氨酸质量/发酵液体积;糖酸转化率的 计算方法为：糖酸转化率％=(发酵液体积L札-色氨酸产量g/L)/发酵耗葡萄糖总质量g* 100% O
[0029] 实施例3 大肠埃希氏菌化T巧发酵生产k色氨酸的方法，包括W下步骤： (1) 、培养成熟的菌种 菌液的制备:取瓶内大肠埃希氏菌化化P已经生长饱满的茄型瓶，将生理盐水55ml在火 焰保护下注入，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种 的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内。
[0030] 成熟的种子的培养： a、 空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力 为0.12MPa，溫度 12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体种子培养基用累累入种子培养罐中，开列管升溫至8(TC后，开蒸汽 进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，溫度12rC，时间为15min; C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:采用压差法进行接种，调P册.9，溫度35°C，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口 防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa，此时种液在压差 下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火 焰灼烧约Imin; e、 培养：培养溫度35 °C，通过补充液氨自动控制6.9-7.1，溶氧>25%，压力0.035- 0.078MPa，风量 0.35VVM-1.8VVM。
[0031] 使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量 为葡萄糖5.8%、酵母粉0.28%、（畑4)2册〇4〇.92%、1((：10.28%、]\%5〇4〇.42%、（畑4)25〇4〇.24〇/〇、 巧樣酸0.42%、FeS〇4 0.00014-0.00042%、MnS〇4 0.00032%、维生素 Bl 0.00039%和生物素 0.000135%，其余为水； (2) 、发酵罐培养 a、 空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力 为0.12MPa，溫度 12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体种子培养基用累累入种子培养罐中，开列管升溫至8(TC后，开蒸汽 进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，溫度12rC，时间为15min; C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内； e、 培养:发酵培养的条件为培养溫度35-37°C，pH采用补充液氨分段控制，0-1化7.0- 7.2，1她-放罐时6.5-6.7，溶氧分段控制，0-1化12-24%，1她-放罐时15-40%，压力0.082- 0.085MPa，风量0.3VVM-2.3VVM，培养过程通过不断添加发酵培养基控制培养基中葡萄糖的 质量浓度为0.01-0.5%; 使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为： 葡萄糖1.3%、酵母粉0.16%、（畑4)2册〇4〇.18%、1(化0.25%、]\%5〇4〇.32%、（畑4)25〇4〇.33〇/〇、 巧樣酸 0.45%、FeS〇4 0.0075%、化 2S〇4 0.00058%、MnS〇4 0.00019%、CuS〇4 0.00002- 0.00018%、C〇C12 0.00132%和ZnS〇4 0.00019%，其余为水。
[0032] 该实施例中发酵周期为32h，心色氨酸的产量为75g/L，糖酸转化率为29%;其中k 色氨酸的产量的计算方法为:心色氨酸产量g/LA-色氨酸质量/发酵液体积;糖酸转化率的 计算方法为：糖酸转化率％=(发酵液体积L札-色氨酸产量g/L)/发酵耗葡萄糖总质量g* 100% O
[0033] 实施例4 大肠埃希氏菌化T巧发酵生产k色氨酸的方法，包括W下步骤： (1) 、培养成熟的菌种 菌液的制备:取瓶内菌种已经生长饱满的茄型瓶，将生理盐水55ml在火焰保护下注入， 并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将含有菌种的生理盐水在无 菌操作下转移到接种瓶内。
[0034] 所述菌种为大肠埃希氏菌化Trp，其分类命名为大肠埃希氏菌（J^cAericAia a已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(CGMCC)，菌种保藏编号 为CGMCC NO. 7.217,保藏日期为2016年5月8号。
[0035] 成熟的种子的培养： a、 空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力 为0.12MPa，溫度 12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体种子培养基用累累入种子培养罐中，开列管升溫至8(TC后，开蒸汽 进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，溫度12rC，时间为15min; C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:采用压差法进行接种，调P册.9，溫度35°C，压力0.06MPa，在火焰下旋开接种口 防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至0.03 MPa，此时种液在压差 下进入罐内，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上，火 焰灼烧约Imin; e、 培养：培养溫度35 °C，通过补充液氨自动控制6.9-7.1，溶氧>25%，压力0.035- 0.078MPa，风量 0.35VVM-1.8VVM。
[0036] 使用的培养基为液体种子培养基，液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量 为：葡萄糖5%、酵母粉0.15%、（畑4)2册〇4 0.86%、KC1 0.075%、MgS〇4 0.37-0.42%、（NH4)2S04 0.19%、巧樣酸0.36%、FeS〇4 0.00037%、MnS〇4 0.00026%、维生素 BI 0.00023%和生物素 0.000085,其余为水； (2) 、发酵罐培养 a、 空罐灭菌:罐体清洗干净，认真检查阀口及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌压力 为0.12MPa，溫度 12rC，时间为45min; b、 实罐灭菌:将液体种子培养基用累累入种子培养罐中，开列管升溫至8(TC后，开蒸汽 进入罐内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.12MPa，溫度12rC，时间为15min; C、降溫冷却:灭菌结束后，打开列管内冷却水进行降溫，降溫至36 °C，关闭列管冷却水； d、 接种:将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内； e、 培养:发酵培养的条件为培养溫度35-37°C，pH采用补充液氨分段控制，0-1化7.0- 7.2，1她-放罐时6.5-6.7，溶氧分段控制，0-1化12-24%，1她-放罐时15-40%，压力0.082- 0.085MPa，风量0.3VVM-2.3VVM，培养过程通过不断添加发酵培养基控制培养基中葡萄糖的 质量浓度为0.01-0.5%; 使用的培养基为液体发酵培养基，液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为： 葡萄糖1.3%、酵母粉0.16%、（畑4)2册〇4〇.4%、1(化0.6%、]\%5〇4〇.2%、（畑4)28〇4〇.16%、巧樣 酸0.2%、FeS04 0.00756%、化2S04 0.002%、MnS04 0.00045%、CuS04 0.00006%、CoCl2 0.00045%和aiS〇4 0.00064%，其余为水。
[0037]该实施例中发酵周期为30h，心色氨酸的产量为80g/L，糖酸转化率为32%;其中k 色氨酸的产量的计算方法为:心色氨酸产量g/LA-色氨酸质量/发酵液体积;糖酸转化率的 计算方法为：糖酸转化率％=(发酵液体积L札-色氨酸产量g/L)/发酵耗葡萄糖总质量g* 100% O
[003引实施例5 大肠埃希氏菌化T巧发酵生产k色氨酸的方法，包括W下步骤： (1 )、培养成熟的菌种:先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子 培养基后再进行实罐灭菌;实罐灭菌结束后降溫冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在 W下条件下进行培养后得到成熟菌种:培养溫度35°C，通过补充液氨自动控制6.9-7.1，溶 氧 > 25%，压力 0.035-0.078MPa，风量 0.35VVM-1.8VVM。
[0039] (2)、发酵罐培养:先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后 再进行实罐灭菌，实罐灭菌结束后降溫冷却，然后将步骤(1)得到的成熟菌种接种至发酵罐 内，在W下条件下进行培养W制取k色氨酸:发酵培养的条件为培养溫度35-37°C，抑采用 补充液氨分段控制，0-1化7.0-7.2，1她-放罐时6.5-6.7，溶氧分段控制，0-1化12-24%， 1她-放罐时15-40%，压力0.082-0.085MPa，风量0.3VVM-2.3VVM，培养过程通过不断添加发 酵培养基控制培养基中葡萄糖的质量浓度为0.0 l-0.5%; 所述菌种为大肠埃希氏菌化化P，其分类命名为大肠埃希氏菌(j^?cAericAia ccL/i ，已 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC NO. 7.217,保藏日期为2016年5月8号。
[0040] 步骤(1)中所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为:葡萄糖1.3%、酵 母粉0.16%、（畑4)2册〇4〇.18%、1(化0.25%、]\^5〇4〇.32%、（畑4)25〇4〇.33%、巧樣酸0.45〇/〇、 FeSCk 0.0075%、化2S〇4 0.00058%、MnS〇4 0.00019%、CuS〇4 0.00002-0.00018%、C〇C12 0.00132%和aiS〇4 0.00019%，其余为水。
[0041] 步骤(2)中所述液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为:葡萄糖1.3%、酵 母粉0.16%、（NH4)2HP04 0.4%、K化0.6%、MgS04 0.2%、（NH4)2S04 0.16%、巧樣酸0.2%、FeS04 0.00756%、化2S〇4 0.002%、MnS〇4 0.00045%、CuS〇4 0.00006%、C〇C12 0.00045%和ZnS〇4 0.00064%，其余为水。
[0042] 该实施例中发酵周期为33h，心色氨酸的产量为77g/L，糖酸转化率为31%;其中k 色氨酸的产量的计算方法为:心色氨酸产量g/LA-色氨酸质量/发酵液体积;糖酸转化率的 计算方法为：糖酸转化率％=(发酵液体积L札-色氨酸产量g/L)/发酵耗葡萄糖总质量g* 100% O
[0043] W上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽 然本发明已W较佳实施例掲露如上，然而并非用W限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述掲示的技术内容作出些许更动或修饰 为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对 W上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
[0044] 本发明中所述大肠埃希氏菌化Trp的筛选方法如下： 1、菌悬液的制备:丞墙体培养，取斜面菌种一环，接种于盛有20ml肉汤培养基的255ml S角瓶中，36 °C振荡培养（120巧m)16-l化。取Iml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养 基的255mlS角瓶中，36°C振荡培养（120巧m)6-化巧细胞菌悬液的制备，取IOml培养液， 35(K)r/min离屯、IOmin，收集菌体，沉淀用IOml生理盐水洗涂离屯、2次，之后将菌体充分悬浮 于12ml生理盐水中。
[0045] 所述大肠杆菌出发菌株为氨基酸技术服务中屯、受让的大肠杆菌，名称为： Escherichia COli K-12 W3110变种。
[0046] 2、紫外诱变:懇取IOml菌液于〇90mm的培养皿中（带有磁棒），将培养皿置于诱变 箱内的磁力揽拌器上;漆开启紫外灯，预热20min，开启磁力揽拌器，打开皿盖分别照射30s。
[0047] 3、紫外诱变处理液在含有(6-内酷胺类抗生素平板上的选择性生长。(6-内酷胺类抗 生素优选青霉素、苯挫西林、万古霉素。抗生素浓度为10化g/ml。
[0048] 选择生长良好的菌种进行培养，制备菌悬液进行硫酸二乙醋(DES)化学诱变。
[0049] 4、硫酸二乙醋(DES)化学诱变:恋祀制硫酸二乙醋溶液，浓度为处理浓度的2倍象 与等体积的菌悬液混合漆诱变结束时加入，过滤灭菌后的硫代硫酸钢中止反应。
[0050] 5、经硫酸二乙醋(DES)化学诱变后的处理液在含有大环内醋类抗生素平板上的选 择性生长。大环内醋类抗生素优选罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福 平。抗生素浓度为10化g/ml。选择生长良好的菌种进行培养。
[0化1] 6、抗生素抗性的鉴定 ;'1>将待测菌种斜面一环接于5ml生理盐水中，充分混匀，350化/min离屯、IOmin，收集菌 体，将菌体充分悬浮于5ml生理盐水中； 3取11111菌悬液于平皿中，倾入约15ml烙化并冷却至45-50°C的基本培养基，摇匀，待凝 固后即为待测平板； 凌将待测平板底背面划分为十个区域，在培养基表面分别贴上薩有青霉素、苯挫西林、 万古霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、利福平和四环素的滤纸片，观 察滤纸片周围菌落的生长情况； #36°C培养2地后显示，除罗红霉素周围无菌落生长外，其他集中均有菌落生长，表明 该菌种对青霉素、苯挫西林、万古霉素、四环素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素和利 福平均有耐药性； 象对该菌种进行传代保藏，命名为大肠埃希氏菌化Trp,保藏于中国科学院微生物研究 所。该菌种其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中屯、。
[0052] W上所述的发酵罐培养基中各成分及其质量百分比含量为:葡萄糖0.75%，酵母 粉0.05%，憐酸氨二钟0.75%，硫酸儀0.2%，硫酸锭0.16%，巧樣酸0.2%，硫酸亚铁0.01%，生 物素0.005%，硫酸儘0.025%和硫酸锋0.0013%，余量为水。
[0化3] 培养条件为:溫度36°C，pH7.0-7.2，压力0.05MPa，通风比0.3-0.8VVM。
[0054] 中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌化T巧进行了形态、生理形态、16RS基 因，W及Antibiotics sensitivity检测，结果显示： 大肠埃希氏菌化T巧完整的ISsrDNA序列（其基因序列如SEQ NO. 1所示）进行NCBI blast分析，比对结果与大肠埃希氏菌有100%的相似性。序列比对的结果结合形态和生理生 化特征，表明属于菌株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
[0055] 大肠埃希氏菌化化P的抗生素抗性检测及检测结果： 本发明所筛选出的大肠埃希氏菌化化P，经K-B法实验检测对30种抗生素的敏感性，其 中对测试的21种抗生素表现为敏感或中度敏感，具体内容参见表1; 表1:
注：S表示敏感，R表示不敏感(具有抗性），M表示中度敏感。
[0056] 本发明相关对比实验： 分两组进行多次发酵实验:A组:采用常规工艺，将大肠杆菌Escherichia COli K-12 W3110变种作为菌种进行发酵生产心色氨酸;B组:采用本发明中的工艺，将大肠埃希氏菌 JLTrp作为菌种进行发酵生产心色氨酸;发酵结束后，分别计算两组实验的产k色氨酸率和 糖酸转化率;具体计算方法为:k色氨酸产量=发酵液中k色氨酸总质量/发酵液体积;糖酸 转化率=(发酵液体积L礼-色氨酸产量g/L)/发酵总耗糖量g*100%。结果如表2所示：
' 实验结果显示，本发明中的工艺方法与普通的工艺相比较胃，!^-色氨酸产量和糖酸转化' 率均有大幅度的提高，具有显著的进步，更适合于工艺生产。
【主权项】
1. 大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 、种子培养:采用不添加抗生素的液体种子培养基对菌种进行扩大培养，得到培养 成熟的种子液； 所述菌种为大肠埃希氏菌几 Trp，其对青霉素、苯唑西林、万古霉素、克拉霉素、阿奇霉 素、红霉素、克林霉素和利福平具有抗性，分类命名为大肠埃希氏菌(i?scAericAia ) 几 Trp，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号 为CGMCC NO. 7.217,保藏日期为2016年5月8日； 所述液体种子培养基中各成分及其质量百分比含量为:葡萄糖1.5-5.8%、酵母粉0.06_ 0.28%、（NH4)2HP〇4〇.82-〇.92%、KCl 0.055_0.28%、MgS〇4 0.075-0.42%、（NH4)2S04 0.06-0.24%、柠檬酸0.08-0.42%、FeS〇4 0.00014-0.00042%、MnS〇4 0.000065-0.00032%、维生素 BI 0 · 000065-0 · 00039%和生物素0 · 000013-0 · 000135%，其余为水； (2) 、发酵培养:将培养成熟的种子液接种到不添加抗生素的液体发酵培养基中进行发 酵培养得到发酵液，从发酵液中提取得到L-色氨酸;发酵培养的条件为培养温度35-37Γ， pH采用补充液氨分段控制，0_18h 7.0-7.2，18h-放罐时6.5-6.7，溶氧分段控制，0-18h 12-24%，18h-放罐时15-40%，压力0 · 082-0 · 085MPa，风量0 · 3VVM-2 · 3VVM，培养过程通过不断添 加发酵培养基控制培养基中葡萄糖的质量浓度为〇. 01-0.5%; 所述液体发酵培养基中各成分及其质量百分比含量为：葡萄糖1.3%、酵母粉0.16%、 (NH4)2HP〇4 0.15-0 · 7%、KCL 0.13-0.7%、MgS〇4 0.06-0.45%、（NH4)2S〇4 0.09-0.43%、柠檬酸 0.05-0.5%、 FeS〇4 0.0015-0.098%、Na2S〇4 0.00051-0.0059%、MnS〇4 0.00015-0.0009%、 CuS〇4 0.00002-0·00018%、C〇C12 0.00014-0.00135%和ZnS〇4 0.00019-0.0020%，其余为水。2. 如权利要求1所述大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤 (1)中所述种子培养，先对种子培养罐进行空罐灭菌，向种子培养罐中加入液体种子培养基 后再进行实罐灭菌;实罐灭菌结束后降温冷却；制备接种用菌液，然后进行接种，在以下条 件下进行培养后得到培养成熟的种子液：培养温度35 °C，pH6.9-7.1，溶氧>25%，压力 0 · 035-0 · 078MPa，风量 0 · 35WM-1 · 8WM。3. 如权利要求2所述大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述 步骤(1)中接种用菌液的制备方法为:取瓶内菌种生长饱满的茄型瓶，在火焰保护下向茄型 瓶内注入生理盐水55ml，并用接种环或者玻璃刮刀将表面菌种刮落入生理盐水中，然后将 含有菌种的生理盐水在无菌操作下转移到接种瓶内，即得到接种用菌液。4. 如权利要求2所述大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述 步骤（1)中接种的具体操作为：调节液体种子培养基pH值为6.9,温度为36°C;在压力 0.065MPa，火焰下旋开接种口防护盖，并迅速将种瓶接种管连接与接种口，缓慢调节压力至 0.03 MPa，接种结束后，在火焰下拔下接种罐，并迅速将接种口防护盖旋在接种口上。5. 如权利要求1所述大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤 (2 )中所述发酵培养，先对发酵罐进行空罐灭菌，向发酵罐中加入液体发酵培养基后再进行 实罐灭菌;实罐灭菌结束后降温冷却，然后将步骤(1)得到的培养成熟的种子液接种至发酵 罐内进行培养得到发酵液。6. 如权利要求2或5所述大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所 述空罐灭菌的具体操作为:罐体清洗干净，检查阀门及人孔后，开蒸汽进行空罐灭菌，灭菌 压力为0.13-0.14]\〇^，温度124-130°(：，时间为40-5511^11。7. 如权利要求2或5所述大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于： 所述实罐灭菌的具体操作为:将种子培养罐或发酵罐的列管升温至82°C后，开蒸汽进入罐 内对培养基进行灭菌，灭菌压力为0.125-0.13MPa，温度124-125Γ，时间为15-25min。8. 如权利要求5所述大肠埃希氏菌JLTrp发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于:所述 步骤(2)中接种的具体操作为:将种子罐内培养成熟的种子液压入发酵罐内。
【文档编号】C12N1/20GK105925633SQ201610554149
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】曹华杰, 刘帅, 李静, 岳贵龙, 张孟涛
【申请人】河南巨龙生物工程股份有限公司