利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌及构建方法和用途

利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌及构建方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌及构建方法和用途，利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌其保藏编号为CGMCC?No.?7999；构建方法为：敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并过量表达乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶，得到进化的出发菌株；并通过进化，得到能够在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中生长的并且乙醛酸循环的通量得到增强的进化菌株；敲除琥珀酸脱氢酶基因、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脱氢酶系，得到利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌。该菌株生长速度快，菌体密度高，从而提高甘油生产琥珀酸的生产速率。
【专利说明】利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌及构建方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种利用甘油生产琥珀酸的菌株及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]琥珀酸又称丁二酸，它作为一种重要的原料在医药、食品、塑料、油漆、农药、染料以及表面活性剂等行业有着广泛的用途。它还是一种重要的平台化合物，可用于合成四氢呋喃、η -甲基吡咯烷酮、2 -吡咯烷酮及丁二醇等。
[0003]琥珀酸的合成方法包括化学合成法和微生物发酵法。其中微生物发酵法由于其环境污染小，成本低，越来越受到各国科研工作者的关注。微生物发酵法生产琥珀酸所用的菌株主要包括产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌等。其中大肠杆菌作为研究最多的模式微生物，其代谢途径比较清楚，基因组信息和调控信息比较全面，各种基因操作手段比较成熟，因此大肠杆菌被广泛用来通过代谢工程的手段生产琥珀酸。近年来由于生物柴油产业的迅猛发展，甘油作为其主要的副产物成为了一种廉价和丰富的工业微生物发酵原料。通过微生物发酵的方式以甘油为底物来生产有价值的化工产品和能源例如有机酸、1，3 -丙二醇、乙醇和氢气等成为目前研究的热点。利用大肠杆菌以甘油为底物生产琥珀酸的研究主要使用厌氧条件或微好氧条件，通过失活副产物途径和增强羧化途径来提高琥珀酸产量。但是由于大肠杆菌在厌氧条件或微好氧条件下的甘油利用速率和生长速率非常缓慢，因此琥珀酸生产速率也相对较低，从而限制了工业化生产。
[0004]构建好氧条件的琥珀酸生产菌株普遍使用的代谢工程策略包括失活琥珀酸脱氢酶使琥珀酸作为终产物积累、敲除副产物生成途径、增强羧化途径和激活乙醛酸循环作为第二条琥珀酸生产途径等。乙 醛酸循环作为其中一条琥珀酸生成途径对于提高琥珀酸产量有非常重要的作用。由于乙醛酸循环受到许多因素的调控，因此通过基因工程的手段调控其通量效果比较有限。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能在好氧条件利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌。
[0006]本发明的第二个目的是提供一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的构建方法。
[0007]本发明的第三个目的是提供一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的用途。
[0008]本发明的技术方案概述如下:
[0009]—种利用甘油生产琥拍酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli),其保藏编号为CGMCC N0.7999。
[0010]一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的构建方法，包括如下步骤:
[0011](I)敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并过量表达乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶，得到进化的出发菌株；
[0012](2)将步骤(I)获得的菌株通过在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中连续转接培养的方式进行进化，得到能够在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中生长的并且乙醛酸循环的通量得到增强的进化菌株；
[0013](3)将步骤(2)获得的菌株通过敲除琥珀酸脱氢酶基因、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脱氢酶系，得到利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
[0014]一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的用途，包括如下步骤:
[0015]在发酵罐中，装入以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基，以6%_8%的体积比将一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌接入所述培养基中，在28-40°C，通气速度为
0.5-1.5vvm，通过调节搅拌速率控制溶氧在饱和溶氧的30%以上，全程控制pH在6.8-7.3，发酵50-60小时，得到含琥珀酸的发酵液。
[0016]本发明的优点:
[0017]本发明采用定性途径进化的方式来增强乙醛酸循环的通量，这种进化方式具有途径定向性，且未见公开，可广泛应用于潜在途径的激活。本发明得到了能够高效利用甘油为底物生产琥珀酸的菌株。本发明的发酵条件可以加快菌体生长速度，提高菌体密度，从而提高甘油生产琥珀酸的生产速率。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1为菌种构建示意图。
`[0019]图2为代谢网络图。
[0020]图3为实施例1中敲除ppc基因的电泳鉴定图。
[0021]图4为实施例1中置换aceBA启动子的电泳鉴定图。
[0022]图5为实施例3中敲除sdhCDAB的电泳鉴定图。
[0023]图6为实施例3中置换ppc启动子的电泳鉴定图。
[0024]图7为实施例3中置换sucAB启动子的电泳鉴定图。
【具体实施方式】
[0025]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
[0026]本发明一种利用甘油生产琥拍酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)命名为BPB18SPS，于2013年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并已存活，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，电话:010-64807355，其微生物保藏编号为CGMCC N0.7999。
[0027]实施例1
[0028]构建定向途径进化的出发菌株
[0029](I)敲除大肠杆菌BL21 (DE3)(购自Novagen公司)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并过量表达乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶，得到进化的出发菌株；
[0030]敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的具体操作如下:[0031]利用扩增引物Kanl/Kan2以质粒pKD3 (购自CGSC)为模板扩增氯霉素抗性基因，在Hind III /Sal I位点克隆到质粒pUC18 (购自Invitrogen公司)中得到质粒pCMOl。
[0032]利用扩增引物Poutl/Pout2以大肠杆菌BL21 (DE3)的基因组为模板扩增ppc基因的上游同源臂，在Hind III位点克隆到质粒pCMOl中，获得质粒pCMppcH。
[0033]利用扩增引物Pout3/Pout4以大肠杆菌BL21 (DE3)的基因组为模板扩增ppc基因的下游同源臂，在BamH I /Sac I位点克隆到质粒pCMppcH中，获得质粒pCMppcHR。
[0034]以质粒pCMppcHR为模板，利用扩增引物Pout5/Pout6扩增得到的片段电转到含有质粒PKD46 (购自CGSC)的大肠杆菌BL21(DE3)的电转感受态中。用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。氯霉素抗性基因再用含有FLP重组酶的质粒pCP20(购自CGSC)删掉，从而得到ppc基因敲除的菌株BP。
[0035](2)过量表达乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶是通过将aceBA操纵子的启动子置换为trc强启动子来实现的。
[0036]具体操作如下:
[0037]首先利用扩增引物Trcl/Trc2,以质粒pTrc99a(购自addgene)为模板,扩增trc启动子，并将扩增得到的片段克隆在质粒PUC18的BamH I /EcoR I位点处,得到质粒pUCtrc。再以PKD4 (购自CGSC)为模板，用引物Kanl/Kan2扩增卡那霉素抗性基因，并将扩增得到的片段克隆到质粒pUCtrc的Hind III /Sal I位点,得到质粒pKMtrc。
[0038]将质粒PKD46转入步骤(I)获得的ppc基因敲除的菌株BP中并制作成电转感受态；利用含有50bp同源臂的引物Ace3/Ace4，以质粒pKMtrc为模板扩增得到的片段转入本步骤获得的电转感受态，并用卡那霉素筛选阳性克隆。卡那霉素抗性基因用含有FLP重组酶的质粒pCP20删掉，从而得到定向途径进化的出发菌株BPB。
[0039]实施例2
[0040]通过定向途径进化的方式提高乙醛酸循环的通量
[0041]为了提高乙醛酸循环的通量来降低琥珀酸生产中副产物α-酮戊二酸的积累，以菌株BPB为出发菌株采用定向途径进化的方式来增强乙醛酸循环的通量。
[0042]具体操作如下:将实施例1获得的菌株BPB在以甘油为唯一碳源的Μ9基本盐培养基中培养，培养条件为37° C，220rpm，并在菌体生长的对数期进行连续转接培养，转接的时间间隔为12小时，培养到100代时，分离到能在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中以比生长速率0.41 1生长的菌株，取其中一株，命名为BPB18。对菌株BPB18进行单基因敲除验证，发现乙醛酸循环成为其最主要的回补途径。通过定向途径进化，该菌株的乙醛酸循环通量得到提高。
[0043]以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基的配制方法为:取Na2HP046.8g，KH2P043g,NaCl0.5g, NH4Cllg ；MgS04.7H200.49g ；CaCl2.2H200.015g ；FeS04.7H202.8X 10_4g ；硫胺素.HCll.0X l(T7g ;CoCl2.6Η207.I X l(T6g，(NH4)6Mo7O24.4H203.7 X 10_6g,MnCl2.4Η201.6Xl(T5g，CuS042.41 X l(T6g，ZnSO4.7Η202.8X l(T6g，H3B042.5 X 10_5g ；3-(N-吗啉基)
[0044]丙磺酸20.9g ;甘油10g，加蒸馏水至1L。
[0045]实施例3
[0046]通过基因工程的方法构建琥珀酸高产菌株[0047]以进化菌株BPB18为出发菌株，通过基因工程手段包括敲除琥珀酸脱氢酶基因、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脱氢酶系构建得到能够利用甘油为底物高效生产琥珀酸的菌株。其中过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脱氢酶系是通过将各自的启动子置换为trc强启动子来实现的。
[0048](I)敲除琥珀酸脱氢酶基因sdhCDAB的具体操作如下:将质粒pKD46转入实施例2获得的进化菌株BPB18中并制作成电转感受态；利用包含45bp上下游同源臂的引物Sdhl/Sdh2，以pKD4为模板，扩增包含卡那霉素抗性基因和上下游同源臂的片段，电转入含有质粒PKD46的本步骤获得的电转感受态，并用卡那霉素筛选阳性克隆。卡那霉素抗性基因用含有FLP重组酶的质粒pCP20删掉，从而得到敲除琥珀酸脱氢酶基因的菌株BPB18S。该菌株能够将琥珀酸作为终产物积累。但是由于琥珀酸脱氢酶基因的缺失使得乙醛酸循环无法作为回补途径，因而该菌株无法在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中生长，因此需要将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因恢复。
[0049](2)过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的具体操作如下:在大肠杆菌BL21 (DE3)中以置换aceBA启动子同样的步骤置换ppc基因的启动子，并以成功发生同源重组的阳性克隆的基因组为模板，以P0ut5/P0ut6为扩增引物，扩增包含上下游同源臂、氯霉素抗性基因和trc启动子的片段。将质粒pKD46转入本实施例获得的菌株BPB18S中并制作成电转感受态；并将本步骤获得的片段电转入本步骤获得的电转感受态中。用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。氯霉素抗性基因再用含有FLP重组酶的质粒PCP20删掉，从而得到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶过量表达的菌株BPB18SP。该菌株由于恢复了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，因此能够在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中生长，并能高效生产琥珀酸。
[0050]为了进一步降低副产物α-酮戊二酸的积累，本发明还过量表达了 α-酮戊二酸脱氢酶系。具体操作如下:利用扩增引物Trcl/Trc2,以质粒pTrc99a为模板,扩增trc启动子，并将扩增得到的片段克隆在质粒PCMOl的BamH I /EcoR I位点处，得到质粒pCMtrc。利用扩增引物SU1/SU2以大肠杆菌BL2`1 (DE3)的基因组为模板扩增sucAB基因的上游同源臂,在Hind III位点克隆到质粒pCMtrc中，获得质粒pCMtrcH。利用扩增引物SU4/U4以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板扩增sucAB基因的下游同源臂，在EcoR I位点克隆到质粒PCMtrcH中，获得质粒pCMtrcHR。然后以该质粒为模板，利用弓I物SU3/U6扩增PCR片段用于电转。用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，并用菌落PCR验证。氯霉素抗性基因再用含有FLP重组酶的质粒pCP20删掉，从而得到α -酮戊二酸脱氢酶系过量表达的菌株BPB18SPS并进行保藏，保藏号为CGMCC N0.7999。该菌株在发酵时副产物α -酮戊二酸的积累量大大减少。
[0051]表I菌株构建所用引物序列
[0052]
【权利要求】
1.一种利用甘油生产琥拍酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli),其保藏编号为CGMCC N0.7999。
2.权利要求1的一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的构建方法，其特征包括如下步骤:(I)敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并过量表达乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶，得到进化的出发菌株； (2)将步骤(I)获得的菌株通过在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中连续转接培养的方式进行进化，得到能够在以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基中生长的并且乙醛酸循环的通量得到增强的进化菌株； (3)将步骤(2)获得的菌株通过敲除琥珀酸脱氢酶基因、过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和α-酮戊二酸脱氢酶系，得到利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。3.权利要求1的一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌的用途，其特征是包括如下步骤:在发酵罐中，装入以甘油为唯一碳源的M9基本盐培养基，以6%-8%的体积比将一种利用甘油生产琥珀酸的大肠埃希氏菌接入所述培养基中，在28-40°C，通气速度为.0.5-1.5vvm，通过调节搅拌速率控制溶氧在饱和溶氧的30%以上，全程控制pH在6.8-7.3，发酵50-60小时，得到含琥珀酸.的发酵液。
【文档编号】C12R1/19GK103436477SQ201310358766
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】陈涛, 李宁, 王智文, 赵学明 申请人:天津大学