一种大肠埃希氏菌株hy-05c高密度培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种大肠埃希氏菌株HY-05C高密度 培养方法。
【背景技术】
[0002] 天冬氨酸又称氨基丁二酸，是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一。天冬氨酸是生 命体中合成赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的前体。L-天冬氨 酸参与鸟氨酸循环，促进氨和二氧化碳生成尿素，降低血液中氨和二氧化碳的含量，增强肝 功能，可用做氨解毒剂、肝机能促进剂、疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂。 天冬氨酸与L-苯丙氨酸合成的二肽甜味剂阿斯巴甜，甜度高、热量低，适于糖尿病、高血压 等患者，安全可靠；以L-天冬氨酸为原料合成的新型强力甜味剂纽甜，不仅适用于包括儿 童、孕妇、哺乳期妇女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者内的所有人群，还适用于不能食用 阿斯巴甜的苯酮尿症患者。
[0003] 目前L-天冬氨酸主要是由产L-天冬氨酸的游离整体细胞一步转化富马酸生产。 生产过程大体如下：首先培养产L-天冬氨酸酶的菌体细胞，然后再将菌体培养液加入到含 有富马酸铵的转化体系中，富马酸铵在L-天冬氨酸酶的作用下转化生成L-天冬氨酸铵，转 化完成后再通过酸解、等电点结晶等得工序得到成品L-天冬氨酸。提高单位体积菌体培养 液的酶活力是提高转化效率的关键。提高单位体积培养液中的酶活性主要有两种方法，一 是通过菌种诱变提高菌体的产酶能力。另外，就是通过培养基和培养条件的优化，提高单位 体积培养液中产酶菌体细胞个数，即增加培养液中菌体细胞浓度。
[0004] 申请人拥有游离整体细胞转化生产L-天冬氨酸的专利菌株（大肠埃希氏菌株 HY-05C，保藏编号为CGMCCNo. 5450)和技术（专利号：201110382584.X)，本发明在原有技 术的基础上，提供一种提高大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度（高细胞浓度）的培养方法， 提高单位体积培养液中产酶菌体细胞的浓度（数量），进而提高单位体积培养液中的L-天 冬氨酸酶活力。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于提供一种高密度培养大肠埃希氏菌株HY-05C的培养基和培养 方法，通过提高单位体积培养液中菌体细胞浓度来提高培养液天冬氨酸酶酶活量，从而提 高单位体积细胞培养液转化富马酸生产天冬氨酸转化效率。
[0006] 所述的大肠埃希氏菌株HY-05C来自烟台恒源生物股份有限公司前期选育的L-天 冬氨酸游离细胞转化法生产菌（记载在申请号为CN201110382584.X，申请日为：2011年 11月25日，发明名称为："高产L-天冬氨酸酶的大肠埃希氏菌株及其应用"。大肠埃希氏 菌株HY-05C保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5450,保藏日期为2011年11月8日。
[0007] 为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，将大肠埃希氏菌株HY-05C进行 液体培养，包括如下步骤：
[0009] 1)菌株HY-05C斜面菌种活化：将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有 活化培养基试管斜面中，35-37°C培养24-36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化 用试管斜面中，35-37°C培养24-36小时，再转接另一斜面，35-37°C培养24-36小时即得活 化斜面菌种。
[0010] 2)制备菌株HY-05C-级种子液：取步骤1)得到的大肠埃希氏菌株HY-05C活化 斜面菌种，接种到装有高密度培养培养基的三角瓶中进行培养，200rpm、35?37°C、摇床培 养6-8小时，得到一级种子液。
[0011] 3)制备菌株HY-05C二级种子液：取步骤2)得到的一级种子液以体积比1-2%。接 种量转接到装有高密度培养培养基发酵罐中进行扩大培养，控制通风比〇. 3-0. 6vvm，相对 溶解氧浓度20-40%，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压0. 05-0. 08MPa，35?37°C培 养7-9小时，得到大肠埃希氏菌株HY-05C二级种子液。
[0012] 4)制备菌株HY-05C转化用培养液：将步骤3)培养好的大肠埃希氏菌株HY-05C 二级种子液以体积比5-10%接种量转接到高密度培养培养基中进行扩大培养，控制通 风比0. 15-0. 25vvm，相对溶解氧浓度20-40%，搅拌转速根据溶解氧需求适当调节，罐压 0. 05-0.08MPa，35?37°C培养8-10小时，制得大肠埃希氏菌株HY-05C转化用培养液。
[0013] 上述的活化斜面培养基所必需的营养物质包括（g/L):富马酸铵10 ;牛肉膏10 ; 蛋白胨7 ;氯化钠5 ;磷酸二氢钾1 ;硫酸镁0. 2,琼脂15?20,pH7. 0?7. 2。
[0014] 上述的高密度培养培养基所必需的营养物质包括（g/L):富马酸铵7?12;玉米 干粉6?8 ;酵母粉1?4 ;蛋白胨6?8 ;氯化钠5 ;磷酸二氢钾1 ;硫酸镁0. 2,pH6. 0? 7. 5。
[0015] 更优选地：富马酸铵10 ;玉米干粉8 ;酵母粉2 ;蛋白胨7 ;氯化钠5 ;磷酸二氢钾1 ; 硫酸镁 〇? 2,pH6. 0。
[0016] 上述高密度培养培养基是通过单因素和正交设计试验优化得到的，考察指标为单 位体积培养液中的菌体量和天冬氨酸酶活力，优化过程见实施例4。
[0017] 上述菌株HY-05C高密度培养的工艺控制参数（接种量、培养时间、通风量、相对溶 解氧浓度）是通过培养试验优化确定的，考察指标为最终用于转化的培养液中单位体积的 菌体量和天冬氨酸酶活力。具体优化过程见实施例4。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 1.本发明通过对大肠埃希氏菌株HY-05C培养基和培养条件的优化，显著提高了 大肠埃希氏菌株HY-05C转化用培养液中的菌体浓度和天冬氨酸酶酶活力，进而提高后续 转化效率和设备利用率。
[0020] 2.与原工艺相比，本发明大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养工艺，通过对培养基 和培养条件的优化，单位体积培养液中菌体量较之前提高了 40% -50%、天冬氨酸酶活力 提高了 70-80%，效果显著。
[0021] 3.与原工艺相比，本发明大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养工艺，采用三级培 养，增加二级种子液，采用10%大接种量接入最终培养大罐，不仅缩短了大罐培养时间，同 时使得获得的培养液中的菌体生长更加整齐，相对酶活力明显增加，转化试验证明，相同体 积的转化用培养液转化效率明显提高。
【附图说明】
[0022] 图1菌株HY-05C培养基优化正交实验效应曲线图
[0023] 图2菌株HY-05C-级种子液菌体浓度和天冬氨酸酶活变化曲线
[0024] 图3菌株HY-05C二级种子液菌体浓度和天冬氨酸酶活变化曲线
[0025] 图4菌株HY-05C转化用培养液菌体浓度和天冬氨酸酶活变化曲线
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0027] 本发明实施例中所涉及的菌种：大肠埃希氏菌株HY-05C，保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 5450,保藏日期为2011年11月8 曰。
[0028] 实施例1
[0029] 一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0030] 1、菌种活化
[0031] 将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化培养基（培养基配方（g/ L):富马酸铵1〇;牛肉膏1〇;蛋白胨7;氯化钠5;磷酸二氢钾1;硫酸镁0. 2,琼脂15?20， pH7. 0?7. 2)试管斜面中，35°C培养24小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化培养 基试管斜面中，35°C培养24小时，再转接另一斜面，35°C培养24小时即得活化斜面菌种。
[0032] 2、高密度培养培养基配制
[0033] 按以下配方配制细胞培养培养基：富马酸10g/L，玉米干粉8g/L，酵母粉2g/L，蛋 白胨7g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾lg/L，硫酸镁0. 2g/L，将上述原料加适量水溶解，然后 用氨水调节pH至6. 0,定容，121 °C下灭菌20分钟。
[0034] 3、一级种子液的制备
[0035] 取2支上述新鲜活化斜面菌种分别接入5L的摇瓶中，培养基装液量1200ml， 200rpm，35°C，摇床培养8小时，培养液稀释10倍，在640nm测0D值为0. 468,得到一级种子 液。
[0036] 4、二级种子液的制备
[0037] 将经上述培养获得的一级种子液（2XlOOOmL)转接到装有1. 5m3高密度培养培养 基的2m3培养罐中，调整罐压0. 06MPa，通风比0. 25vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中 相对溶解氧20%，35°C培养8小时，取培养液稀释10倍，在640nm测0D值为0. 498,得到二 级种子液。
[0038] 5、转化用培养液制