一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒。肠出血性大肠杆菌EHEC为出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征的病原体。引起人类疾病的主要是O157：H7血清型。现有技术的检测方法耗时耗力，检测不便，而本发明提供了特异性检测肠出血性大肠杆菌EHEC的试剂盒，试剂盒中含有特异性结合肠出血性大肠杆菌EHEC的适配子，所述适配子为单链DNA。本发明试剂盒具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。
【专利说明】-种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒 发明领域
[0001] 本发明属于食品检测技术领域，具体设及一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测 的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肠出血性大肠杆菌化肥C)是大肠杆菌的一个亚型，E肥C分为157、111等血清型，主 要致病菌株为〇157:H7,可引起感染性腹泻，因能引起人类的出血性肠炎而得名。2011年5 月，德国爆发肠出血性大肠杆菌病。据罗伯特?科赫研究所6月观日公布的最新疫情通报， 德国一个多月来肠出血性大肠杆菌感染病例累计达3901例，截至27日，死亡患者已达47人。 报告还指出，本次德国疫情与W往产志贺毒素大肠杆菌造成的疫情不同，其特点为:一、感 染病例中溶血性尿毒综合征重症病例所占比例达25%，远高于W往疫情;二、溶血性尿毒综 合征病例中成人患者约占89%，且多数是女性。而W往产志贺毒素大肠杆菌感染者多数是 儿童，且没有明显性别差异;=、W往疫情致病菌大多数是血清型0157型大肠杆菌，运次则 是0104型；四、本次感染的潜伏期平均为8天，W往是3到4天。
[0003] 目前，国内外在食品中大肠杆菌检测时常用的检测方法因其检测手段、识别对象 各有不同而各具优缺点。传统检测大肠杆菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法 鉴定，耗时、不灵敏是运些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好， 但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应(PCR)技 术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚 合酶链式反应(PCR)技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应(PCR)技术，如多重 PCR技术，然而多重PCR虽简化了PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩 增，很容易产生非特异性条带或假阳性，影响检测结果。
[0004] 通过指数富集配体的系统进化（Systematic evolution of ligands by e邱onential enrichment ,SELEX)技术筛选获得的寡核巧酸序列称为适配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核巧酸文库，其随机序列长度 在20-100个碱基左右，将随机寡核巧酸文库与祀分子相互作用，保留结合的寡核巧酸配基， 经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该祀子特异结合的寡核巧酸序列得到富集，最终获得 祀分子的特异寡核巧酸配基。该技术具有库容量大、祀分子范围广、亲和力高、特异性强等 优点。在临床检测方面，特别是对一些未知的致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部 结构、功能W及运些物质的表位，但将其作为祀物质，通过SELEX技术筛选到其相应的适配 子，W检测祀物质，已成为该领域的研究热点。
[0005] 利用SELEX技术筛选获得的适配子识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类 抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫源性限制，可体外人工合 成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室溫运输等。更重要的是，适配子的祀分 子更为广泛，包括金属离子、有机染料、氨基酸、细胞因子、辅因子、氨基糖巧、抗生素、碱基 类似物、核巧酸和多肤等。其中蛋白质类祀分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细 胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒和细菌病原体，甚至完整的细胞也可W通过复合 祀子SELEX技术或消减SELEX技术筛选出高亲和力的寡核巧酸配基。适配子比抗体具有更高 的特异性和精确识别能力，甚至能识别单抗不能区分的蛋白质分子。运些特性使得适配子 在生物医药和食品卫生研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了一种高特异高敏感检测肠出血性大肠杆菌E肥C的方法，提高了它的 检测和诊断效率。
[0007] 为了解决现有大肠氏菌检测中存在的检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本 发明提供一种特异识别肠出血性大肠杆菌E肥C的试剂盒及其应用。
[000引上述试剂盒，适配子可W采用生物素标记。
[0009] 本发明中，所述的核酸适配体能够特异结合肠出血性大肠杆菌。
[0010] 本发明另外提供一种肠出血性大肠杆菌邸6(：适配子的筛选方法。
[001。 随机单链DNA文库和引物由上海生物工程郁良公司合成。
[0012] 随机单链DNA文库：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n35代表35个A、T、C、G碱基中任意一种的35个集合）。
[0013] 引物1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0014] 引物n :5'-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3'
[0015] 引物虹：5 ' -地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0016] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0017] 2. SELEX筛选获得肠出血性大肠杆菌E肥C特异的寡核巧酸适配子 [001引 1)沈LEX筛选过程：
[0019] a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA IOiig加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性 5min，然后迅速置于冰上IOmin;
[0020] b.加入ImL肠出血性大肠杆菌E肥C菌悬液2.0 X IO8，于37°C摇床10化pm结合1.2小 时，使单链DNA文库与菌充分作用；
[0021] C.更换离屯、管，W去除与管壁结合的单链DNA，室溫下离屯、10 000巧m离屯、IOmin分 离未与菌结合的单链DNA文库；
[0022] d.弃上清，加入60化L IX冲洗缓冲液，离屯、10 00化pm离屯、IOmin，重复此过程4 次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；
[0023] e .接上步离屯、后去上清，加入10化L去离子水99°C加热3min，高速离屯、18 OOO^m 离屯、15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存备用。
[0024] 2)PCR富集与肠出血性大肠杆菌E肥C特异结合的寡核巧酸适配子：
[0025] 每轮筛选后获得的与肠出血性大肠杆菌E皿C特异结合的寡核巧酸适配子文库通 过PCR扩增得到富集；
[00%] a. W上述上清为模板，通过引物I和引物IV扩增产生一端带生物素标记的双链 DNA ；
[0027] b. PCR扩增条件:95 °C预变性3min，然后进行30循环95 °C变性35s，60 °C退火37s，72 。(:延伸33s，最后72°C延伸lOmin;
[00%] c.PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作 用与链亲合素交联的磁珠结合，经过IX连接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涂3次，用IOOmM的新鲜化OH 37°C变性30min，使不带生物素的单链 DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。
[0029] 3)重复筛选:重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行15轮筛选，其中 第6、9轮分别用克雷伯菌、肠出血性大肠杆菌进行反筛。
[0030] 特异识别肠出血性大肠杆菌E肥C的寡核巧酸适配子的核巧酸序列如下：
[0031] E肥C-I:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTTTMTAAACAATACCTCCCATCCCTCTCCTTTCGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0032] E肥C-2:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTTTACTATCCCCATCATCTTATCATAAACTTTACGACCAAG TGACAGTGACGAG
[00；33] E 肥 C-3: TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTATTMACCACAAAACACTTTMCCTTCACTAACGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0034] E肥C-4:TTGGACAGTGGACGTGAAGCAAATCAACAATACATTATATCAATTACACATCTCCGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0035] E肥C-5:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTTACCACCTACACAATCTATCACTTATAACTTCAGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0036] E肥C-6:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTACCACCTACACAATCTATCACTTATAACTTCAAAGACCAAG TGACAGTGACGAG
[00；37] E 肥 C-7: TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTMTTACCCCCTCTTCAAACACAATCTATAAAATGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0038] E肥C-8:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCATATCAACACCTCACTCCTTATTCCCAACTATTTGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0039] E肥C-9:TTGGACAGTGGACGTGAAGCATACCTTACCCTATCCAAACAATCTATCTCCCACCGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0040] E肥C-IO:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCCCTATCCACAATTTTAATACAAATCTCTAAATAAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0041 ] E肥C-11:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCCTATTATTTATAACACATCACACCATCTCATCATGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0042] E肥C-12:TTGGACAGTGGACGTGAAGCACACCTATTCCCCCTCCCTTCCTCTACTAATCAAAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0043] E肥C-13:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTACCATCCATAACCTCCATACCTCAAAACTATTATGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0044] E肥C-14:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTTTACCTATAAAATAAATCTCTTCTATTCTTACAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0045] E肥C-I5:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTACCTCTACAAATTCCACTTCATACTACTCCTTTCGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0046] E肥C-16:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCATATACATCCCCAACATCTACCTACCCAAAAATAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0047] E肥C-17:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTCAATCTCTCTCTATATCATTCCTCCTTTMTCAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[004引 E肥C-18:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTATTACCCTTCAATCACAACACCATTATACTATTAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0049] E肥C-19:TTGGACAGTGGACGTGAAGCATTCCATCCATTCTTMTCTCTATACATAATACTCGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0050] E肥C-20:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTTTCCACCACATTACCACCTTACCTCAATTACCCGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0051 ] E肥C-21:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTAAATCACACCATTCACCTCAATCATAATCTTMAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0052] E肥C-22:TTGGACAGTGGACGTGAAGCATCCTTATCCCTCCATCACTACCATTMCTCTAACGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0053] 本发明通过SELEX技术的筛选过程，获得高亲和性特异识别肠出血性大肠杆菌 E肥C的寡核巧酸适配子(适配体），用于快速、准确检测肠出血性大肠杆菌E肥C。
[0054] W上述核酸适配子筛选文库为基础，可对文库两端的固定序列的个别核巧酸进行 替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或 缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行核 酸适配子的筛选、PCR扩增和分析与应用。
[0055] 本发明的有益效果:本发明设计出了一个性能优秀的随机单链寡核巧酸文库。文 库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核巧酸的 多样性。文库固定序列（引物序列）的独特设计能使用高退火溫度进行PCR扩增，既能有效获 得目的产物，又能有效抑制非特异性产物。本文库及引物应用于肠出血性大肠杆菌E皿C的 核酸适配子筛选获得成功，所述的适配子可W用于制备检测试剂盒，从而用于食品中的肠 出血性大肠杆菌E皿C的检测。本方法具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等 优点，在食品与卫生安全检测中能够得到广泛应用。
【具体实施方式】
[0056] 实施例1肠出血性大肠杆菌E肥C菌液的制备
[0化7] 将购买的E皿C 0157 :H7抓L933的菌株，在LB液体培养基试管中，37摄氏度，ISOr/ min摇动过夜，备用。
[005引实施例2适配子的获得
[0059] 1、随机单链DNA文库和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0060] 随机单链DNA文库：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n35代表35个A、T、C、G碱基中任意一种的35个集合）。
[0061 ]引物 1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0062] 引物 n : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0063] 引物虹：5 ' -地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0064] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0065] 2. SELEX筛选获得肠出血性大肠杆菌E肥C特异的寡核巧酸适配子
[0066] I)沈LEX筛选过程：
[0067] a.首轮筛选，取合成的随机单链DNA IOiig加入到400ul IX结合缓冲液，95度变性 5min，然后迅速置于冰上IOmin;
[006引 b.加入ImL肠出血性大肠杆菌E肥C菌悬液2.0 X IO8，于37°C摇床10化pm结合1.2小 时，使单链DNA文库与菌充分作用；
[0069] C.更换离屯、管，W去除与管壁结合的单链DNA，室溫下离屯、10 000巧m离屯、IOmin分 离未与菌结合的单链DNA文库；
[0070] d.弃上清，加入60化L IX冲洗缓冲液，离屯、10 00化pm离屯、IOmin，重复此过程4 次，目的是洗去未与菌结合的核酸片段；
[0071 ] e .接上步离屯、后去上清，加入10化L去离子水99°C加热3min，高速离屯、18 OOO^m 离屯、15min弃沉淀，换管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存备用。
[0072] 2)PCR富集与肠出血性大肠杆菌E肥C特异结合的寡核巧酸适配子：
[0073] 每轮筛选后获得的与肠出血性大肠杆菌E皿C特异结合的寡核巧酸适配子文库通 过PCR扩增得到富集；
[0074] a. W上述上清为模板，通过引物I和引物IV扩增产生一端带生物素标记的双链 DNA ；
[0075] b. PCR扩增条件:95 °C预变性3min，然后进行30循环95 °C变性35s，60 °C退火37s，72 。(:延伸33s，最后72°C延伸lOmin;
[0076] C.PCR产物纯化后，一端带生物素标记的双链DNA通过生物素-链亲合素之间的作 用与链亲合素交联的磁珠结合，经过IX连接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)缓冲液洗涂3次，用IOOmM的新鲜化OH 37°C变性30min，使不带生物素的单链 DNA从链亲合素交联的磁珠上洗脱下来，测定其单链DNA的浓度，用作下一轮筛选的富集库。
[0077] 3)重复筛选:重复上述SELEX筛选过程和PCR扩增富集过程，共进行15轮筛选，其中 第6、9轮分别用克雷伯菌、肠出血性大肠杆菌进行反筛。
[0078] 4)富集寡核巧酸适配子与菌结合率的测定：
[0079] 第13、14、15轮SELEX筛选的产物，W标记地高辛的引物虹和标记生物素的引物IV 进行PCR扩增，纯化的PCR产物与链亲和素标记的磁珠充分反应并用化OH解链，地高辛标记 的单链DNA游离在上清中；
[0080] 5)富集寡核巧酸适配子文库的测序结果与分析：
[0081 ] a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pEGM-T载体，转化E. COl i D册a，随机挑取 65个阳性克隆进行DNA序列测定，其中22个为可用序列，见SEQ ID N0:l-22所示；
[0082] 实施例3结合特性验证
[0083] 将适配子分别取1.化g，用牛小肠碱性憐酸酶(CIP)37°C消化化，纯化回收去憐酸 化的DNA;通过T4多核巧酸激酶标记[丫-32P]ATP于去憐酸化的DNA分子末端。10皿〇1放射性 标记的DNA适配子分别与不同浓度的菌体37°C解育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤 过，洗涂滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。 计算各个适配子与菌体的解离常数。结果如下：
[0084]
[0085]
[0086] 从W上结果可W看出，本发明的22个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合所述的菌体。
[0087] 实施例5菌体的鉴定
[0088] 寡核巧酸适配子SEQ ID NO: 1-22的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 标记径基巧光素(FAM)。
[0089] 取5'FAM巧光标记的寡核巧酸适配子沈Q ID NO:l-22(l〇〇nM)各30化L，分别与肠 出血性大肠杆菌E肥C，肠侵袭性大肠杆菌、化脈性链球菌、金黄色葡萄球菌、沙口氏菌、肠致 病性大肠埃希菌EPEC(1.5X108)于37°C解育化，用lXBB(50mM Tris-HCKpH 7.4)，5mM KCl，100mM NaCl，ImMMgC12)洗涂2次后，将菌体重悬于500化 IX B B，用抓 FACSC alibur 流式细胞分析仪检测结合上FAM标记的适配子的菌体百分率(测=次取平均值），结果显示 肠出血性大肠杆菌E肥C寡核巧酸适配子竞争结合肠出血性大肠杆菌E皿C的能力为99.7%, 而针对肠侵袭性大肠杆菌、化脈性链球菌、金黄色葡萄球菌、沙口氏菌菌、肠致病性大肠埃 希菌EPEC没有结合率。
[0090] 运充分说明，本发明的适配子具有较好的特异性和稳定性。
[0091] W上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒，其含有能特异性结合肠出血性大 肠杆菌的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体序列如SEQ ID No: 1-22任一 所示。3. -种检测食品中肠出血性大肠杆菌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所 述的试剂盒。
【文档编号】C12Q1/10GK105925661SQ201610483856
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】杨国林
【申请人】杨国林