一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体 的抗原蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 鸭出血性卵巢炎是2010年在我国中南部种鸭和蛋鸭主产区突发的一种主要引起 产蛋下降的新发传染病，病原为坦布苏病毒（Tembusuvirus，TMUV)，属于黄病毒科黄病毒 属的恩塔亚病毒群，是国际上首次发现的能致鸭发病的虫媒黄病毒。据国家水禽产业技术 体系的调研数据显示，2010年，我国因该病造成的经济损失达50亿元，是当前困扰我国养 鸭业的重要传染病之一。
[0003] 截止目前，GenBank数据库收录了 9株鸭源、1株鹅源、1株鸡源共11株鸭出血性 卵巢炎病毒（DTMUV)的基因序列，病毒株名称分别为YY5株、duck/SD/CHN/2010株、BYD-1 株、Fengxian株、CJD05/CHN/2010 株、Huabei株、HBJL株、JS804 株、muscovy/SD/ChIna2011 株、FS株、JM株。11株DTMUV的多聚蛋白、NS5、E基因核苷酸序列同源性均大于98%。
[0004] 在鸭出血性卵巢炎的诊断方面，当前国内学者已建立了检测病原的RT-PCR以及 LAMP等检测方法，如公开号为CN102876815A的中国专利文献公开了一种快速检测鸭出血 性卵巢炎病毒的RT-PCR法，可特异性、敏感性及重复性的对鸭出血性卵巢炎病毒进行检 测。而目前，鸭出血性卵巢炎病毒抗体的检测只能采用病毒中和试验，该法费时费力，灵敏 性差，不易于高通量检测。
[0005] 因此，研制开发适用于鸭出血性卵巢炎抗体检测的特异的、敏感的、快速的检测方 法，对开展鸭出血性卵巢炎流行病学调查和建立科学、灵活的疫苗免疫程序，以及对疫病的 早期预警具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种用于检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的抗原蛋白及其应用，该抗 原蛋白能够和鸭出血性卵巢炎病毒抗体特异性接合，具有很高的特异性和敏感性，且为非 全病毒抗原，安全性好。
[0007] -种抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] DTMUV属于黄病毒科（Flaviviridate)黄病毒属（Flavivirus)，DTMUV基因组由 5'端和3'端非编码区和一个开放阅读框组成，编码三个结构蛋白和七个非结构蛋白，三个 结构蛋白分别为核衣壳蛋白（C)、膜蛋白（PrM/M)和囊膜糖蛋白（E)，其中，DTMUVE蛋白是 病毒离子表面最主要的结构蛋白，由501个氨基酸残基构成，含有1个糖基化位点。
[0009] 根据黄病毒科成员的结构特点，推测DTMUVE位于病毒表面，在病毒感染靶细胞的 受体结合、膜融合和侵入过程中起着关键的作用。DTMUVE蛋白在病毒感染早期即可诱导机 体产生血凝抑制抗体、补体结合抗体、中和抗体，从而引起宿主产生保护性的免疫应答，同 时E蛋白还具有神经侵袭性和神经毒性的致病性位点，为病毒进入神经细胞的必要蛋白。
[0010] 黄病毒E蛋白在空间上形成三个不同的结构域，即DpD^Dm。DI包含E1~51、 E137~196和E293~311位的130个氨基酸残基、具有糖基化位点和生物活性的抗原表 位；Dn包含E52~136和E197~292位的181个氨基酸残基，具有中和活性和血凝活性的 抗原表位；Dni包含E312~411位的100个氨基酸残基，参与受体结合过程。
[0011] 本发明抗原蛋白包含241个氨基酸，包含两个重复的蛋白片段，该蛋白片段包含 了鸭出血性卵巢炎病毒E蛋白的第三结构域，如此设计有助于提高抗原蛋白的结合抗体的 灵敏度和蛋白的纯化。
[0012] 本发明还提供了一种编码所述的抗原蛋白的基因。
[0013] 本发明还提供了一种含有所述基因的表达盒、重组载体。所述的重组载体中，原始 载体可以为pET28a。
[0014] 本发明还提供了一种含有所述基因的转化子。所述的转化子中，宿主细胞可以为 大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0015] 本发明还提供了所述抗原蛋白的制备方法，包括：利用逆转录PCR扩增位于鸭出 血性卵巢炎病毒囊膜蛋白（E蛋白）基因上的第三结构域（Dm)，利用引物不同，分别得到片 段Dni-1和片段Dm-2,两个片段扩增区域相同（均如SEQIDNO. 1所示），两个片段通过内 切酶位点连接后与表达载体重组，转入宿主菌并进行基因表达，分离纯化获得所述的抗原 蛋白。
[0016] 逆转录PCR所采用RNA模板可以从感染鸭出血性卵巢炎病毒YY5株的病变BHK-21 细胞中提取。
[0017] 其中，扩增Dm_l所用引物如下：
[0018] 5 ' 端引物：5 ' -GGGCCATGGGCAATGACAACAGGTGGA-3 ' ；
[0019] 3' 端引物：5' -TTTGCGGCCGCGGCGCTGGCGTTTGGA-3' ；
[0020] 扩增Dni-2所用引物如下：
[0021] 5' 端引物：5' -GGGGCGGCCGCGCAATGACAACAGGTGGA-3' ；
[0022] 3 ' 端引物：5 ' -TTTCTCGAGGGCGCTGGCGTTTGGA-3 '。
[0023] 所述的表达载体可以为pET28a。
[0024] 所述的宿主菌可以为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0025] 本发明提供了所述抗原蛋白在制备检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体试剂盒中的应 用。
[0026] 本发明还提供了一种含上述抗原蛋白的检测鸭出血性卵巢炎病毒抗体的试剂盒， 尤其是ELISA试剂盒。
[0027] 具体的，上述的鸭出血性卵巢炎病毒为鸭出血性卵巢炎病毒YY5株。
[0028] 所述ELISA试剂盒一般包括抗体检测板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶标 二抗贮存液、底物贮存液、底物缓冲液、洗涤液以及终止液。
[0029] 所述的抗原检测板为包被了上述的抗原蛋白的酶标板，包被抗原蛋白时，可采用 pH9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液作包被液，所述抗原蛋白的包被量优选为0. 5~1yg/孔，更 优选为〇. 5yg/孔。
[0030] 所述的样品稀释液为含10% (v/v)成年牛血清，0. 05%吐温_20(v/v)，0. 01%硫 柳汞钠（w/v)的0? 01M磷酸盐缓冲液。
[0031] 所述的阳性对照为经鸭TMUV灭活疫苗免疫健康鸭获得的高免阳性血清经稀释得 到，所述阳性对照的〇D45Qnm> 0. 8。
[0032] 所述的阴性对照为健康非免疫健康鸭血清经稀释得到，所述阴性对照的 OD450nm^ 0. 2〇
[0033]为配置阳性、阴性对照，可采用含0. 1 %BSA(v/v)、0. 01 %硫柳汞钠（w/v)和 0. 05 %吐温-20 (v/v)的0. 01M磷酸盐缓冲液（pH7. 4)分别稀释上述鸭血清。
[0034] 所述的酶标二抗贮存液为酶标二抗经稀释得到。
[0035] 所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG(H+L)结合物，所述酶标二 抗最佳工作浓度为0. 1-0. 25yg/ml。
[0036] 配置所述的酶标二抗贮存液时，可采用含0. 2%BSA(v/v)，0. 1%吐温-20(v/v)， 0. 02%硫柳汞钠，pH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释所述的酶标二抗。
[0037] 所述的底物贮存液为四甲基联苯胺（TMB)的二甲基亚砜（DMS0)溶液，四甲基联苯 胺的质量百分比浓度为1%，所述底物贮存液的最佳工作浓度为〇. 16mg/ml。
[0038]所述的底物缓冲液的组成为0. 2MNa2P(V液257ml，0. 1M柠檬酸液243ml，0. 5g过 氧化氢尿素，加蒸馏水定容至l〇〇〇ml。
[0039] 所述的洗涤液为含0. 5 %吐温-20的0. 1M磷酸盐缓冲液。
[0040] 所述的终止液为2M硫酸溶液。
[0041] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0042] (1)本发明抗原蛋白为非全病毒抗原、安全性好，不含无关杂蛋白，只与血清中病 毒抗体特异结合，不与鸭其它疫病阳性血清发生交叉反应，灵敏度和特异性较高。
[0043] (2)本发明抗原蛋白通过基因工程手段克隆表达得到，在表达过程中抗原蛋白以 包涵体形式在宿主菌中存在，且含有6XHis标签，易于分离纯化，可以进行工业化生产。 [0044] (3)本发明试剂盒操作简便快速，检测时样品无需预处理，样品需求量少，无需另 配其它试剂，在2小时内即可完成检测。结果判定形象、准确、灵活，可高通量检测。
【附图说明】
[0045]图1为本发明目的基因凝胶电泳分离图谱；
[0046] 图2为目标蛋白SDS-PAGE分析图谱；
[0047] M为蛋白质Marker;1为重组大肠杆菌诱导前菌体蛋白；2为重组大肠杆菌诱导4h 表达产物；
[0048] 图3为表达产物r2Dm蛋白的Westernblot鉴定图谱；
【具体实施方式】
[0049] 下面结合【具体实施方式】，对本发明作进一步的阐释和说明。
[0050] 本发明实施例中所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0051] 实施例1获得目的蛋白
[0052] 取感染鸭出血性卵巢炎病毒YY5株（全基因组序列GENBANK登录号：JF270480)的 病变BHK-21细胞，用UNIQ-10柱式TRIzol总RNA提取试剂盒（上海生工）提取病毒RNA， 具体操作参照说明书进行。以提取的病毒总RNA为模板进行逆转录，逆转录体系20yL如 下：
[0053] 病毒总RNA6yL;5XM-MLVBuffer4yL，dNTP(10mmol/L)lyL;RNase抑制剂 (20U/L) 0? 5yL;M-MLV1yL;E蛋白Dm基因下游引物（5 '-mCTCGAGGGCGCTGGCGITTGGA-3 '）1yL;DEPC水补足体积至20yL。移入42°C恒温水浴箱中保温lh，然后在冰中冷却2min， 即获得cDNA第一链。
[0054] 以上述cDNA为模板进行PCR扩增，扩增Dm_l所用引物如下：
[0055] 5 ' 端引物：5 ' -GG(;CCATGG(;(JAATGACAACAGGTGGA_3，
[0056] 3 ' 端引物：5 'TTTGCCCCCCCGGCGCTGGCGTTTGGA-3 '
[0057] 5'端引物引入NcoI酶切位点，3'端引物引入NotI酶