一种Ⅰ群4型禽腺病毒疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗制备技术领域，具体设及一种I群4型禽腺病毒疫苗。 技术背景
[0002] I群禽腺病毒组成了腺病毒科的禽腺病毒属。II群（火鸡出血性肠炎和相关病 毒）和III群（减蛋综合征）腺病毒与疾病的关系明确，相比之下，大多数I群的禽腺病毒对 禽类的致病作用还未完全确定。但FAdV-1和FAdV-4明显属于例外，其中FAdV-1能引起鹤 譜支气管炎，FAdV-4是屯、包积水肝炎综合征的主要病因。当鸡的健康受到损害时，如并发 感染鸡传染性贫血病毒（CIAV)和传染性法氏囊病病毒（I抓V)等其他病原，其他的腺病毒 毒株可使条件性致病原发生快速感染。I群禽腺病毒已鉴定了 5个禽腺病毒，其名称用字 母A~E表示。每个种内的病毒主要根据交叉中和实验结果进一步分为不同的血清型。病 毒颗粒直径为70~90nm，无囊膜，呈20面体对称结构。病毒核酸为双股DNA，占整个病毒 粒子的11. 3%~13. 5%，其余部分为蛋白质。病毒六邻体是主要的衣壳蛋白，含有型、群和 群特异性抗原决定簇，因而感染后可产生相应的型、群和群的特异性抗体。
[0003] I群禽腺病毒呈世界性分布，各年龄段家禽均易感。可W通过水平和垂直两种途 径传播。虽然感染鸡的12个血清型之间及血清型内部的毒力各有不同，但12个血清型均 能诱发包涵体肝炎（IBH)。FAdV-4引起的屯、包积水肝炎综合征化服）的主要临床症状为 产蛋下降和引起死亡（死亡率在20 %~80 % )，主要病理变化是屯、包腔中有淡黄色清亮的 积液，肝脏肿大、苍白，肾脏肿大，屯、脏和肝脏出现多发性局灶性坏死，肝细胞中见核内包涵 体。1987年，己基斯坦首次发现屯、包积水肝炎综合征化服），不到一年，皿S就摧毁了己基 斯坦的家禽养殖业。之后在印度、科威特、伊朗、日本和前苏联也发现该病。如今，世界各地 都有皿S的踪影，遍及拉下美洲-中东和亚洲的一些国家。
[0004] 通过对I群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，且呈逐年 上升趋势。发病的宿主范围越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病。特别 是2010年W后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流行。临床表现包涵体肝炎（IBH)、屯、 包积水肝炎综合征（H服）。随着我国养鸡业的迅速发展，I群禽腺病毒的发病率给饲养业造 成了严重的经济损失。关于该病的防治，国外已有预防I群禽腺病毒的商品化疫苗，至今国 内尚无疫苗可用，导致I群禽腺病毒防控存在漏桐。研制安全有效的I群禽腺病毒灭活疫 苗，为提高国内I群禽腺病毒疫苗的防控能力和防止I群禽腺病毒蔓延奠定基础。
【发明内容】
阳0化]本发明提供了一种I群4型禽腺病毒疫苗，用于预防鸡屯、包积水肝炎综合征，从 而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明中制备禽腺病毒灭活疫苗，其抗原为灭活后的YBAV-4株病毒。
[0007] 所使用的I群4型禽腺病毒YBAV-4株，该病毒株于2015年10月15日保藏于武 汉武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCNO.V201541。
[0008] 上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醒灭活；
[0009] 所述疫苗的制备方法包括在YBAV-4株病毒液中加入终浓度0. 2%的甲醒，37°C揽 拌灭活16h，灭活的病毒液与油佐剂1 : 2混合乳化，得到禽腺病毒灭活疫苗。 阳010]本发明制备的I群4型禽腺病毒灭活疫苗，利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫 苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的禽腺病毒灭活疫苗对禽能够提供有效的免疫保 护，具有很好的商品化开发前景。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1
[0012] YBAV-4株的分离与鉴定
[0013] 1、流行病学调查自2010年W来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出 现了一种W死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、屯、包积水为特点的疾病，经临床调查和实 验室检测，初步诊断为I群C-4型禽腺病毒引起的屯、包积水肝炎综合征。2010年，发明人从 山东溜博某养殖场有包涵体肝炎和屯、包积水典型症状的病死鸡肝脏中成功分离到1株病 〇
[0014] 2、病毒分离取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬 液；反复冻融3次后，30(K)r/min离屯、30min，取上清；加入青霉素和链霉素各lOOOOIU/ml， 4°C过夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液W0. 2ml/胚的 剂量，经卵黄囊途径接种6. 5日龄SPF鸡胚，弃24h内死胚，取接种4化~16化内死亡鸡 胚的尿囊液和胎儿，用上述方法处理后连续传代，观察第3代死胚的肝组织，鸡胚表现为死 胚、胚体矮小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎儿，一 20°C保存。
[0015] 3、病毒的鉴定
[0016] 3. 1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液5~10ml，反复洗3~5次，末次用 生理盐水将血细胞泥稀释成0. 8%、1 %和2%浓度，4°C保存备用。按常规方法检测分离毒 株是否具有凝集运些红细胞的特性。同时设III群禽腺病毒邸SV-76为凝集反应阳性对照。 结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。III群 禽腺病毒邸SV-76能够凝集鸡、鸭的红细胞。
[0017] 3. 2理化特性检验参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别W5-漠尿喀 晚-2'-脱氧核巧度UDR)、氯仿、乙酸、盐酸加3)、氨氧化钢加10)、溫度（60°C、lh)处理 后，接种鸡胚化2ml/胚），另设生理盐水处理组作为对照。接种5d后观察鸡胚病变。结 果：分离毒分别经脚DR、氨氧化钢（pHlO)和60°C、lh处理后，接种鸡胚，鸡胚表现正常，PCR 检测阴性。表明脚DR能抑制病毒在鸡胚中的复制，分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐 碱，对热敏感，60°C，lh可被灭活。而经乙酸、氯仿和盐酸（P册）处理的毒株，不影响病毒在 鸡胚中的增殖，出现明显的鸡胚病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有脂质囊膜，对乙酸 和氯仿有抵抗力，耐酸。 阳0化]3. 3血清学鉴定
[0019] 3. 3. 1群特异性鉴定利用琼脂凝胶扩散试验（AG巧制备琼脂凝胶平板对分离毒 株进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm， 孔距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔加I群禽腺病毒标准株、EDSV-76京 911株标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37°C作用，24~4化观察是 否出现凝集沉淀线。结果：分离毒抗原仅能与I群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线， 而与III群禽腺病毒邸SV-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。
[0020] 3. 3. 2型特异性鉴定I群禽腺病毒1~12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再 按2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法，将I群禽腺病毒1~12型标准毒株、 分离毒对I群禽腺病毒1~12型标准阳性血清进行交叉中和试验，记录中和效价结果。结 果：分离毒测4型标准阳性血清的中和效价（1:501)与4型标准毒株测4型标准阳性血清 的中和效价（1:537)较接近；分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1:10W下。 表明分离株是血清4型。
[0021] 3.4PCR检测及基因测序病鸡肝脏无菌研磨，反复冻融3次，利用柱式动物DNA提 取试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测。1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性