专利名称：人工改造的缺陷型人3型腺病毒的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于人工改造的病毒在疫苗、肿瘤和基因治疗方面的应用领域。腺病毒作为表达载体，通过表达外源基因，在肿瘤治疗和基因治疗方面具有十分广阔的应用前景，可广泛应用于医学、生物学等相应领域；同时开发出高效安全的腺病毒疫苗，在预防腺病毒相关呼吸道疾病方面具有重要意义。
背景技术：
目前发现的腺病毒已有51个血清型，它是一类主要感染人类呼吸道和消化道的病原体。人类腺病毒能够引起急性咽炎、婴幼儿致死性肺炎、流行性结膜炎、膀胱炎、肠炎等多种组织的炎症以及扁桃体、腺体组织和淋巴组织的隐性或持续性感染。腺病毒感染可在全球范围内广泛流行、传染性强。腺病毒感染在我国也非常普遍，腺病毒肺炎是我国发病率最高的一种病毒性肺炎。
在治疗上，腺病毒感染同其他病毒性疾病一样没有特效药物，一般都只能采取对症治疗，主要是靠机体自身的免疫系统的抵抗反应、消灭病毒而痊愈。我国目前尚没有预防腺病毒感染的疫苗的研制，在该方面尚属空白。研究表明，机体产生的腺病毒抗体对同型病毒具有长久而稳定的保护性。因此，若能以腺病毒外壳蛋白刺激机体产生一定水平的抗体，则可以起到预防该亚型腺病毒感染的作用。
另一方面，腺病毒是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体，它具有如下优点宿主细胞范围广泛，既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞；容易制备高滴度病毒粒子，可达1011pfu/ml；而且在受染细胞内不发生整合，因此没有致癌和致突变的危险；可插入大片段的外源基因。目前开发出的腺病毒载体主要是人5型腺病毒。然而5型腺病毒感染细胞需要特定的受体(柯萨奇-腺病毒受体)存在，一些细胞缺乏相应的受体，感染效率很低。而3型腺病毒的受体(CD46)存在范围更广，以3型腺病毒为载体可以感染多种细胞，应用更广。
以上所述条件为人工改造的缺陷型人3型腺病毒在基因治疗载体和疫苗研制方面的应用前景提供了坚实的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种缺陷型人3型腺病毒，它能用作疫苗或腺病毒载体。
为了解决上述任务，本发明采取以下措施(1)大量增殖人3型腺病毒临床分离株(广州市儿童医院保藏)，提取病毒基因组DNA，进行特定的基因操作，使病毒E1基因缺失，使之丧失在正常的宿主细胞内增殖的能力。该缺陷型基因组DNA转染到相应的可以提供缺失基因蛋白表达的包装细胞内，进行腺病毒颗粒的包装，包装得到的病毒具备完整的病毒外壳，但是基因组是部分缺失的，在正常的宿主细胞中不能增殖。
(2)提纯包装得到的缺陷型腺病毒，作为疫苗进行人体免疫，可以预防人3型腺病毒的感染。
(3)该缺陷型人3型腺病毒还可作为载体，插入外源基因，在特定的包装细胞内表达外源基因或用作基因治疗。
本发明与现有技术相比，具有下列优点我们研制的复制缺陷型的腺病毒，虽然因其基因组的缺陷而不能复制，但在相应的包装细胞内仍然具有完整的野生型腺病毒的外壳，故仍然具有感染人体细胞的能力，可通过感染机体，诱发人体产生针对人3型腺病毒的特异性保护抗体而达到接种免疫的目的，但又因其不再复制而不会增殖引起疾病，比普通的减毒疫苗安全性更高。同时在特定的包装细胞内可以表达外源基因。
具体实施例方式
实施例1缺陷型人3型腺病毒的构建(1)培养HEp-2细胞，增殖人3型腺病毒，提取病毒全基因组。
(2)PCR扩增3型腺病毒1-580bp(AdL1)和3000-6354bp(AdL2)片段。
(3)连接AdL1和AdL2为AdL。
(4)SalI酶切腺病毒基因组，回收6354bp-35273bp大片段(AdR)。
(5)连接AdL和AdR，得到AdLR，转染到特定的含有3型腺病毒E1区基因片段的HA细胞中。
(6)在HA细胞中进行同源重组，利用蚀斑分离技术分离重组的缺陷型的3型腺病毒。
(7)利用荧光定量PCR技术确定分离得到的病毒是否为缺陷型。
(8)接种分离得到的病毒到HEp-2细胞，确定病毒是否能够自我复制。
(9)大量增殖重组缺陷型3型腺病毒，病毒纯化后拟作为疫苗。
实施例2缺陷型人3型腺病毒外源基因的表达(1)PCR扩增待表达的基因序列，插入真核表达框，含有CMV启动子及PolyA。
(2)两端连接AdL1和AdL2片段。
(3)与缺陷型3型腺病毒基因组AdLR共转染进含有3型腺病毒E1区基因片段的HA细胞中，进行同源重组。
(4)荧光定量PCR技术筛选含有待表达基因序列的重组缺陷型腺病毒。
(5)大量增殖该腺病毒，病毒纯化后作为基因治疗用；或者直接纯化出HA细胞中表达的该外源基因。
权利要求
1.一种缺陷型人3型腺病毒，其特征在于(a)病毒E1基因部分缺失；(b)该缺陷型病毒在正常的宿主细胞内无法增殖，只能在特定的提供缺失基因蛋白表达的包装细胞中复制；(c)在包装细胞中可以产生完整的病毒粒子；(d)在包装细胞中产生的腺病毒粒子其基因组是不完整的，但仍然具备感染性。(e)该病毒可以感染人体，引起免疫反应，刺激人体产生特异性抗体，但在人体细胞内不能进行增殖。
2.根据权利要求1所述的一种缺陷型人3型腺病毒，其特征在于该缺陷型人3型腺病毒可以用作疫苗或者载体，插入外源基因，在特定的包装细胞内表达外源基因或用作基因治疗。
全文摘要
本发明公开了一种经过人工改造的缺陷型人3型腺病毒，它能用作疫苗或基因治疗载体。本发明所述的缺陷型人3型腺病毒含有完整的病毒外壳，但是其基因组是缺陷的，不能在普通的宿主细胞内增值，只能在特定的包装细胞内复制。该缺陷型病毒可以用于免疫人体，产生3型腺病毒特异的保护抗体，预防人3型腺病毒的感染。又因其在人体内不能复制，所以不会致病，具有更高的安全性。该缺陷型腺病毒也可以用作载体，插入外源基因，在特定的包装细胞内增值，表达外源蛋白，或用于基因治疗。
文档编号A61P31/00GK101082042SQ20061003566
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者龚四堂, 周荣, 曾其毅, 张其威, 黄茜华 申请人:广州市儿童医院, 广州华银医药科技有限公司