基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种基于CRICPR_Cas9体外改造腺病毒载体的方 法，特别涉及一种基于CRICPR-Cas9体外改造5型腺病毒纤毛基因的方法。
【背景技术】
[0002] 5型腺病毒(Adenovirus type 5，Ad5)是目前应用于各种重大疾病临床前治疗和 临床治疗研究的主要运载工具。腺病毒的纤毛由尾巴、杆、头节3部分组成，在感染细胞过程 中发挥重要的作用，腺病毒感染细胞的过程开始于纤毛的头节结合细胞表面的特异性受 体，不同血清型的腺病毒所识别的细胞表面受体存在较大差异（Nicklin S A，Wu E， Nemerow G R,et al.The influence of adenovirus fiber structure and function on vector development for gene therapy[J] .Mol Ther. 2005,12(3): 384-393·)。通过将5 型腺病毒中编码纤毛头节和杆区的基因与其他血清型腺病毒纤毛头节和杆区编码基因进 行替换重组，形成嵌合型腺病毒载体，能够显著提高病毒感染特定类型细胞的效率。比如35 型腺病毒结合细胞的天然受体是CD46,该分子在T淋巴细胞中有较高水平表达。Ad5F35嵌合 型腺病毒能在保留Ad5的所有特性基础上显著提高感染T淋巴细胞的效率（Schroers R， Hildebrandt Y,Hasenkamp J,et al.Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35chimeric adenoviral vectors[J]·Exp Hematol. 2004，32(6): 536-546.) jdSFl 1嵌合型腺病毒则能显著提高感染细胞因子诱导杀 伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK)的效率（Stecher H，Shayakhmetov D M， Stamatoyannopoulos G,et al.A capsid-modified adenovirus vector devoid of all viral genes: assessment of transduction and toxicity in human hematopoietic cells[J].Mol Ther.2001,4(1):36-44.)。然而腺病毒载体其基因组全长36Kb，用常规的分 子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造。
[0003] 规律成族间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat;CRISPR_associated，CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复 合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成DNA双链断裂(Double-strand breaks， DSB)。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，已被广泛用于细胞水平、动 物水平研究。理论上Cas9蛋白在sgRNA(single guide RNA)的引导下可以切割任何存在NGG (以及NAG)间隔相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM)的上游DNA〇
[0004] 目前，尚未有基于CRICPR-Cas9基因编辑技术体外改造5型腺病毒载体制备Ad5F35 嵌合型腺病毒的方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点 对其进行改造的问题，以及点突变试剂盒对超过l〇kb的大载体进行突变时容易引起二次突 变（由于PCR酶保真性引起的随机突变）的技术难点，本发明提供一种适用于大质粒载体改 造的分子克隆方法。
[0006] 本发明所提供的分子克隆方法，具体可为如下三种中的任一种：
[0007] 第一种:将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒的方法，具体 可包括如下步骤：
[0008] (a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5'-Nx-NGG-3'或5'-CCN-Nx-3'序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为靶序列1;以所述出发质粒上所述靶标基因 的终止区域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为 靶序列2;N表示A、G、C和T中的任一种，14SXS30,且X为整数(如X为18或20)，Nx表示X个连 续的脱氧核糖核苷酸；
[0009] 针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反 向互补;针对所述靶序列2设计合成双链DNA2,所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反 向互补；
[0010] (b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体 外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2;
[0011] (c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了 所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；
[0012] (d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片段 的上下游末端部分的序列，设计并合成自5'端到3'端依次为上游同源臂、所述目的基因、下 游同源臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3'端序列相同； 所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5'端序列相同；
[0013] (e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段 与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的骨架片段 的连接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组环形质粒。
[0014] 第二种:在出发质粒的靶标片段中插入目的基因得到重组环形质粒的方法，具体 可包括如下步骤：
[0015] (a)以所述出发质粒上所述靶标片段中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排 列规则的序列中的"Nx"所示序列为靶序列;N表示A、G、C和T中的任一种，14 < X < 30，且X为 整数(如X为18或20)，Nx表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；
[0016] 针对所述靶序列设计合成双链DNA，所述双链DNA中的一条链与所述靶序列反向互 补；
[0017] (b)将所述双链DNA构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所 述靶序列的向导RNA;
[0018] (c)采用Cas9蛋白和所述向导RNA切割所述出发质粒，获得在所述靶标片段中被切 开的线性出发质粒；
[0019] (d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述线性出发质粒的上下 游末端部分的序列，设计并合成自5'端到3'端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源 臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列与所述线性出发质粒的3'端序列相同；所述下游同源 臂的序列与所述线性出发质粒的5'端序列相同；
[0020] (e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段 与所述线性出发质粒进行同源重组，完成所述目的基因与所述线性出发质粒的连接，即获 得在所述出发质粒的所述靶标片段中插入所述目的基因的重组环形质粒。
[0021]第三种:将出发质粒的靶标基因缺失得到重组环形质粒的方法，具体可包括如下 步骤：
[0022] (a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5'-Nx-NGG_3'或5'-CCN- Nx-3'序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为靶序列1;以所述出发质粒上所述靶标基因 的终止区域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为 靶序列2;N表示A、G、C和T中的任一种，14SXS30,且X为整数(如X为18或20)，Nx表示X个连 续的脱氧核糖核苷酸；
[0023] 针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反 向互补;针对所述靶序列2设计合成双链DNA2,所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反 向互补；
[0024] (b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体 外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2;
[0025] (c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了 所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；
[0026] (d)根据所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5'端 到3'端依次为上游同源臂和下游同源臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列与所述出发质 粒的骨架片段的3'端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5'端 序列相同；
[0027] (e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段 与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因缺失的 重组环形质粒。
[0028] 其中，所述向导RNA(或所述向导RNA1或所述向导RNA2)为由crRNA和tracrRNA通过 部分碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA;所述crRNA含有能够与所述靶序列（或所述 靶序列1或所述靶序列2)互补结合的RNA片段。
[0029] 在上述方法的步骤(a)中，所述靶标基因的起始区域为