组质粒，即为Ad5F35嵌合型腺病毒载体。
[0099]上述实施例仅是以构建Ad5F35嵌合腺病毒载体为例阐明本发明所提供的改造大 质粒载体的方法，本发明的保护范围包括但不限于以上构建Ad5F35嵌合腺病毒载体的方 法。
【主权项】
1. 分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒，其特 征在于:所述方法为包括如下步骤： (a) 以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 ' 序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为靶序列1;以所述出发质粒上所述靶标基因的终 止区域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为靶序 列2;N表示A、G、C和T中的任一种，14SXS30,且X为整数，Nx表示X个连续的脱氧核糖核苷 酸； 针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互 补;针对所述靶序列2设计合成双链DNA2,所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互 补； (b) 将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转 录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2; (c) 采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述 靶标基因的所述出发质粒的骨架片段； (d) 根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片段的上 下游末端部分的序列，设计并合成自5'端到3'端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同 源臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3'端序列相同;所述 下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5'端序列相同； (e) 将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所 述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的骨架片段的连 接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组环形质粒。2. 分子克隆方法，为在出发质粒的靶标片段中插入目的基因得到重组环形质粒，其特 征在于:所述方法为包括如下步骤： (a) 以所述出发质粒上所述靶标片段中符合5'-Nx-NGG-3'或5'-CCN-Nx-3'序列排列规 则的序列中的"Nx"所示序列为靶序列;N表示A、G、C和T中的任一种，14 < X < 30，且X为整数， Nx表示X个连续的脱氧核糖核苷酸； 针对所述靶序列设计合成双链DNA，所述双链DNA中的一条链与所述靶序列反向互补； (b) 将所述双链DNA构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述革巴 序列的向导RNA; (c) 采用Cas9蛋白和所述向导RNA切割所述出发质粒，获得在所述靶标片段中被切开的 线性出发质粒； (d) 根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述线性出发质粒的上下游末 端部分的序列，设计并合成自5'端到3'端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的 DNA片段;所述上游同源臂的序列与所述线性出发质粒的3'端序列相同；所述下游同源臂的 序列与所述线性出发质粒的5'端序列相同； (e) 将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所 述线性出发质粒进行同源重组，完成所述目的基因与所述线性出发质粒的连接，即获得在 所述出发质粒的所述靶标片段中插入所述目的基因的重组环形质粒。3. 分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因缺失得到重组环形质粒，其特征在于:所述 方法为包括如下步骤： (a) 以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 ' 序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为靶序列1;以所述出发质粒上所述靶标基因的终 止区域中符合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排列规则的序列中的"Nx"所示序列为靶序 列2;N表示A、G、C和T中的任一种，14SXS30,且X为整数，Nx表示X个连续的脱氧核糖核苷 酸； 针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互 补;针对所述靶序列2设计合成双链DNA2,所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互 补； (b) 将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转 录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2; (c) 采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述 靶标基因的所述出发质粒的骨架片段； (d) 根据所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5'端到3' 端依次为上游同源臂和下游同源臂的DNA片段;所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的 骨架片段的3'端序列相同;所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5'端序列 相同； (e) 将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所 述出发质粒的骨架片段进行同源重组，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因缺失的重组 环形质粒。4. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，所述靶标基因的起始区域 为：自所述靶标基因的5 '末端核苷酸起，向上游方向延至80bp处，记为A点；向下游方向延至 80bp处，记为B点；在所述出发质粒上自所述所述A点起至所述B点止，且包含所述靶标基因 的片段即为所述靶标基因的起始区域； 所述靶标基因的终止区域为：自所述靶标基因的3'末端核苷酸起，向下游方向延至 80bp处，记为C点；向上游方向延至80bp处，记为D点；在所述出发质粒上自所述C点起至所述 D点止，且包含所述靶标基因的片段即为所述靶标基因的终止区域。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述出发质粒为全长10-50kb的 环形质粒;或 所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度为15-80bp;或 步骤(e)中，进行所述同源重组的方法为Gibson连接法。6. 权利要求1-5中任一所述的方法在改造腺病毒载体中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述腺病毒载体为pAD-DEST 5型腺病毒载 体； 所述靶标基因为5型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因； 所述目的基因为35型腺病毒纤毛头节和杆区的编码基因。8. -种构建Ad5F35嵌合型腺病毒载体的方法，包括如下步骤： (1)采用Cas9蛋白、向导RNA1和向导RNA2切害UpAD-DEST 5型腺病毒载体，回收所述pAD-DEST 5型腺病毒载体的骨架大片段;所述向导RNA1为序列表中序列7所示的单链RNA;所述 向导RNA2为序列表中序列8所示的单链RNA; (2) 以35型腺病毒纤毛基因为模板，采用由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA 组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物； (3) 利用Gibson连接法将步骤（1)获得的所述pAD-DEST 5型腺病毒载体的骨架大片段 和步骤（2)获得的所述PCR产物进行同源重组拼接，所得产物即为Ad5F35嵌合型腺病毒载 体。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于:步骤（1)中，所述向导RNA1和所述向导RNA2 是按照包括如下步骤的方法制备获得的： (al)合成名称为正向单链DNA1和名称为反向单链DNA1的两个单链DNA;所述正向单链 DNA1的序列如序列表中序列1所示;所述反向单链DNA1的序列如序列表中序列2所示;合成 名称为正向单链DNA2和名称为反向单链DNA2的两个单链DNA;所述正向单链DNA2的序列如 序列表中序列3所示;所述反向单链DNA2的序列如序列表中序列4所示； (a2)将所述正向单链DNA1和所述反向单链DNA1进行退火反应，得到双链DNA1;将所述 正向单链DNA2和所述反向单链DNA2进行退火反应，得到双链DNA2; (a3)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外 转录获得所述向导RNA1和所述向导RNA2。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(a3)中，所述"将所述双链DNA1和所 述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中"为:将所述双链DNA1与线性化的pUC57-sgRNA expression vector连接获得pUC57_T7_pADsgRNAl质粒;将所述双链DNA2与所述线 性化的pUC57_sgRNA expression vector连接获得pUC57_T7_pADsgRNA2质粒;所述线性化 的pUC57_sgRNA expression vector为米用Bsal对pUC57_sgRNA expression vector进行 酶切后的产物。
【专利摘要】本发明公开了一种基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法。本发明还提供了适于改造大质粒载体的分子克隆方法，包括如下：根据出发质粒的待改造位点设计合适的sgRNA，采用Cas9蛋白和sgRNA体外切割所述出发质粒，再基于同源重组的方法将被切割的出发质粒与目的基因相连接，从而完成改造。本发明所提供的方法有效的解决了大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题。该方法是点突变试剂盒的改进，点突变试剂盒一般就包括对目的蛋白进行点突变、构建结构域缺失的截短体等，本发明有效解决了点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点。
【IPC分类】C12N15/66
【公开号】CN105602972
【申请号】CN201610037192
【发明人】张普民, 唐立春, 张卜兮
【申请人】北京蛋白质组研究中心
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月20日