棉花纤维特异表达启动子tb7p1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体的说，涉及一种棉花纤维特异表达启动子 TB7P1及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是棉花生产和消费大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。传统 的育种方法曾在棉花品种改良上取得了较大的成功，但近20年来，世界棉花品种的产量已 经达到平台期。因此，利用现有的遗传资源和传统育种手段难以再大幅度提高棉花产量。基 因工程方法具有后代易于稳定，育种周期短等优点，可以打破物种间的遗传障碍，实现优良 目的基因的定向转移。利用基因工程改良棉花产量和纤维品质是解决这一难题的有效途 径。但基因工程在作物改良中的作用发挥取决于三个方面的进展程度：目标基因的功能、调 控目标性状的分子机理和控制目标基因在特定部位和特定时间表达的特异启动子。在棉花 纤维品质和产量的基因工程改良中，常常需要在纤维细胞中超量或抑制一些基因的表达， 来达到提高产量或改良品质的目的。在棉花纤维发育的分子机理研究中，也需要纤维细胞 特异表达启动子来上调或下调目标基因的表达，进而分析其在纤维细胞中的功能。最大限 度地减少目标基因对其他组织和器官的不良影响。但是，目前已报道的具有棉花纤维特异 性的启动子非常有限。因此，棉花纤维特异启动子的克隆，对棉花纤维发育相关基因功能研 究和棉花纤维的基因工程改良，具有十分重要的意义。
[0003] 近年来，植物组织器官和发育特异性表达的研究成为植物分子生物学的一个重要 研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织器官和 特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于棉花纤维的发育 直接影响纤维的品质和产量。因此，研究和筛选纤维特异表达的启动子不仅有助于解析基 因表达调控的分子机制，并可为植物基因工程提供有用的调控元件，有着重要的理论意义 和应用价值。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明要解决现有技术对棉花纤维特异性表达启动子的研究和筛选不 足的技术问题，提供了一种棉花纤维特异表达启动子TB7P1及其应用。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种棉花纤维特异性表达启动子TB7P1所 述启动子TB7P1的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0000] 本发明还公开了 一种含有上述启动子TB7P1的表达载体。
[0007] 进一步的，所述表达载体为植物表达载体。
[0008] 优选的，所述植物表达载体为ρΒΙ121-ΤΒ7Ρ1::⑶S。
[0009] 本发明再公开了一种含有上述表达载体的宿主。
[0010]优选的，所述宿主为根癌农杆菌。
[0011] 优选的，所述根癌农杆菌为农杆菌LBA4404。
[0012]本发明再公开了一种上述启动子TB7P1在制备转基因植物中的应用。
[0013]优选的，所述转基因植物为棉花。
[0014] 本发明再公开了一种上述表达载体在制备转基因植物中的应用。
[0015] 优选的，所述转基因植物为棉花。
[0016] 本发明再公开了一种含有上述植物表达载体的宿主在制备转基因植物中的应用。
[0017] 优选的，所述转基因植物为棉花。
[0018] 本发明再公开一种利用启动子TB7P1制备转基因植物的方法，包括以下步骤：
[0019] (1)将所述启动子TB7P1插入到表达载体中，构建植物表达载体；
[0020] (2)将获得植物表达载体导入宿主，获得转化体；
[0021] (3)用所述转化体转化植物，培养转化后的植物，获得转基因植物。
[0022] 进一步的，所述转基因植物为棉花，包括以下步骤：
[0023] (1)将所述启动子TB7P1可操作地插入到表达载体中，构建植物表达载体；
[0024] (2)将获得植物表达载体导入宿主，获得转化体：
[0025] (3)用所述转化体转化棉花愈伤再生组织，培养所述棉花愈伤再生组织，经筛选和 诱导获得含棉花纤维特异性启动子TB7P1的棉花植株。
[0026] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0027] 1)本发明提供了微管蛋白基因 GhTUB7的启动子(TB7P1)及应用，该启动子是一个 棉花纤维细胞特异表达启动子。
[0028] 2)本发明利用基因工程技术成功地分离了棉花纤维特异表达的GhTUB7基因的启 动子，所述TB7P1启动子含2010bp片段。
[0029] 3)本发明还验证了 TB7P1启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报 告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维 特异性表达的启动子。
[0030] 4)本发明的TB7P1启动子与组成型启动子(如CaMV35S启动子)相比，具有较高的表 达效率(多数纤维特异性启动子表达效率极低)和纤维表达特异性;在改良纤维的基因工程 中，能够很好地避免目的基因在其它组织器官表达带来的副作用。
[0031 ] 5)本发明为进一步研究基因在纤维发育中的功能提供了新选择，同时为改良棉花 品种和纤维品质的分子设计提供了有效途径。
[0032]当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0033]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发 明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中： [0034]图1为本发明实施例1中GhTUB7基因在棉花不同器官和组织中的表达特性；
[0035]图2为本发明实施例1中GhTUB7基因在棉花纤维和胚珠不同发育时期的表达特性； [0036]图3为本发明实施例1中TB7P1启动子序列上具有的顺式调控元件；
[0037]图4为本发明实施例2中pBI121-TB7Pl: :GUS植物表达载体图谱；
[0038] 图5为本发明实施例2中启动子分析植物表达载体的酶切验证电泳图；
[0039] 图6为本发明实施例3中扩增验证转基因棉花中的GUS基因电泳图；
[0040]图7为本发明实施例3中TB7P1启动子在转基因棉花根、茎和叶中的表达情况图； [00411图8为本发明实施例3中TB7P1启动子在转基因棉花花器官中的表达情况图；
[0042]图9为本发明实施例3中TB7P1在转基因棉花纤维发育过程中的表达情况图。
【具体实施方式】
[0043] 以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0044] 除非另有说明，本发明实施例中的试剂、药品、材料均为市售可得，方法均参考《分 子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。
[0045]在本发明的下述实施例中，所用的棉花实验材料为徐州142(Gossypium hirsutum L.cv徐州142)，来源于中国农业科学院棉花研究所。转基因受体为冀棉14,来源于河北农业 大学。
[0046] 实施例一
[0047] 1、棉花RNA的提取
[0048] 选取新鲜棉花材料(根、茎、叶、花、开花后0天的胚珠和纤维至开花后6天的胚珠和 纤维、开花后6天的纤维至开花后20天的纤维、开花后6天的胚珠至开花后20天的胚珠），利 用北京艾德来(Aidlab，中国）生物科技公司的EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（货号： RN09)提取各个样品的总RNA，具体操作按说明书进行。
[0049] 2、cDNA-链合成
[0050] 利用宝生物工程有限公司（TakaRa，中国大连）的cDNA -链合成试剂盒 (PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，货号：RR047A)和实验 1 提取的总RNA， 合成cDNA-链。于-20 °C冻存产物。
[0051] 3、GhTUB7基因在棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期中的表达特性
[0052]