运用实时定量PCR扩增分析GhTUB7的表达水平。采用实时定量PCR试剂盒（Bio- Rad)进行扩增，在20微升的反应体系中包括10微升扩增混合缓冲液(试剂盒提供），5'_端和 3'_端引物各1微升(5微摩/升），cDNA-链1微升，用水补足至20微升。循环参数为94 °C预变 性3分钟；94°C，30秒，54°C，30秒，72°C，30秒，预设循环数为40。用棉花Histone3基因作内 标，Histone3的5 ' -引物是GhHISI (5 ' -ATGCCCAAGGACATCCAGTTG-3 '）（如SEQ ID N0 · 2所示）， 3 ' -引物为GhHIS2 (5 ' -CCTACCACTACCATCATGGCT-3 '）（如SEQ ID NO · 3所示）。扩增GhTUB7基 因的5 '-引物序列为GhTUB7-l (5 '-ACAGAAGCGGAAAGTAACA-3 '）（如SEQ ID N0· 4所示），3 '-引 物序列为GhTUB7-2(5'-AATAAACAAGCCAAAGTGA-3'）（如SEQ ID N0.5所示）。
[0053]按上述实验1和2的方法获得棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期的总RNA 进行实时定量RT-PCR分析。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程 序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带，每个样品重复3次。
[0054] 结果如图1所示，GhTUB7基因在棉花根、茎、叶、花、雄蕊和雌蕊中都不表达，在开花 后16天的胚珠中有微量表达，在开花后16天的纤维细胞中表达量极高。说明GhTUB7基因具 有明显的纤维细胞表达特异性。图2中，0、2、4分别表示开花后0天的胚珠(含纤维)至开花后 4天的胚珠(含纤维）；6-F~22F:分别表示开花后6天的纤维至开花后22天的纤维;6-0~20-0:分别表示开花后6天的胚珠至开花后20天的胚珠。在纤维发育过程中，GhTUB7基因在纤维 细胞发育前期(开花后10天以前)基本不表达，在开花后12天的纤维细胞中，该基因的表达 水平逐渐提高，在开花后20天达到表达峰值，随后稍有下降；同时，该基因在整个胚珠发育 过程中基本不表达。由此说明GhTUB7基因在纤维中特异表达，而且在纤维细胞伸长后期和 次生壁合成期表达水平较高。图1和2中误差棒表示3次生物学重复的标准差。
[0055] 4、棉花基因组DNA的提取
[0056] 取棉花幼叶，利用北京艾德来(Aidlab，中国）生物科技公司的新型植物基因组DNA 快速提取试剂盒(货号:DN15)提取棉花的基因组DNA，-20°C保存备用。具体操作按说明书进 行。
[0057] 5、克隆GhTUB7基因的启动子TB7P1序列
[0058] 利用GhTUB7基因的cDNA序列，搜索已公布的棉花D-亚基因组序列（http:// www. phytozome. net)。获得GhTUB7基因的5 ' -上游调控序列，进而在ATG上游大约2.0Kb处设 计特异引物TB7P1-up (5 '-GGATTCCAACAAGTAACCATT-3 '）（如SEQ ID N0 · 6所示）和在近ATG位 点处设计特异引物TB7Pl-down(5 '-GGCAAAGAAGTGATGATATAC-3 '）（如SEQ ID N0.7所示），以 徐州142基因组DNA为模板进行扩增，20微升的反应体系包含约20纳克棉花DNA，10微升 2XTaq Master Mix(上海近岸科技有限公司，novoprotein，货号:E005_02)，5微摩/升的上 下游引物各1微升，用水补足至20微升。扩增程序为:94°C，5分钟;94°C，30秒，52°C，30秒，72 °C，2.5分钟，35个循环；72 °C延伸10分钟。扩增产物经过电泳回收、将其连接在克隆载体 pMD19(TaKaRa，中国大连)上，形成pMD19-TB7Pl载体，该载体经过转化大肠杆菌、验证和测 序，结果表明扩增片段长度为2010bp，命名为TB7P1，如SEQ ID N0.1所示。序列分析在 PlantCare数据库进行（http: //bioinformatics · psb · ugent · be/webtools/plantcare/ html/)，分析结果见图3,序列中除具有一般启动子所具有的大量TATA框和CAAT框外，还具 有许多特异性响应元件，如厌氧反应元件（TTTGGT)，光反应元件（ATTAAT、TTTCAAA、 AAACTTT、CCACCCAACT、TCTTAC)，乙烯反应元件(ATTTCAAA)，光反应MYB结合位点(AACCTAA)， 胚乳表达元件(TACTG)，防御与胁迫反应元件(CACTTCGTTTA)，水杨酸反应元件(TTTTT)，未 知功能(CTCC)，昼夜节律调控元件(CAATTCTATC)。
[0059] 实施例二
[0060] TB7P1启动子分析植物表达载体PBI121-TB7P1: :GUS的构建
[0061 ] 用Hindm和Xbal内切酶从pMD19-TB7Pl载体上切下TB7P1片段，连接到用Hindm和 Xbal双酶切的pBI121载体片段上，从而使TB7P1片段置换了 pBI121载体中的CaMV35S启动 子。通过酶切验证(见图5)，构建成植物表达载体pB1121-TB7P1: : GUS(见图4)。
[0062] 如图4所示，植物表达载体pBI121-TB7Pl: :GUS中，LB为T-DNA区段左边界;RB为T-DNA区段右边界;Karf为卡那霉素抗性基因；GUS为β-葡萄糖酸苷酶基因（报告基因）；Nos-T 为冠癭碱合成酶基因终止子。
[0063] 图5中，M15为DNA Marker 15(MBI);1和2为没有接入TB7P1片段的质粒；3~6表示 已经接入TB7P1片段的pBI121-TB7Pl: :GUS质粒。样品1和2中没有酶切出2000bp左右的片 段，样品3-6中酶切出2000bp左右的片段，说明样品1和2中没有TB7P1片段，而样品3-6的图 谱表明样品中已经含有TB7P1片段，启动子TB7P1已经成功插入pBI121载体，植物表达载体 PBI121-TB7P1: :GUS构建成功。
[0064] 实施例三
[0065] 1、棉花的遗传转化
[0066]用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转 化。
[0067] 参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌 LBA4404菌株。
[0068] 上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如 下：
[0069] 冀棉14(河北农业大学提供)种子剥去外壳，用0.1 %的升萊(HgCl2)灭菌10分钟， 用大量无菌水冲洗8次。在125毫升三角瓶中加入约35毫升无菌水震荡过夜，次日换一次无 菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28 °C，黑暗条件下萌发2~3天， 此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。
[0070] 转化用的含PBI121-TB7P1: :GUS植物表达载体的农杆菌菌株在含50毫克/升卡那 霉素(Kan)和125毫克/升链霉素(Sm)的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5毫升 含相同抗生素的YEB液体培养基中，28 °C、200转/分钟震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液 按1: 20的比例转接到25毫升含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至0D600值约为 0.6~0.8，10000转/分钟、1分钟离心收集菌体，菌体用等体积的液体共培养基重悬备用。 [0071 ]转化时，将棉花下胚轴切成1.5~2.0厘米的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆 菌菌液侵染，条件为28°C摇床120转/分钟，侵染30分钟。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共 培养基上，28 °C暗培养2-3天。
[0072]共培养后，下胚轴段转入到下胚段筛选培养基，28°C光照培养，约20天继代一次， 直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一 次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28°C、120转/ 分钟摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0