一种同时检测海水鱼类三种致病菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖动物病原菌检测领域，具体涉及一种蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧 菌和海豚链球菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 獅鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)和海膝链球菌 (Streptococcus iniae)是三种常见的海水养殖鱼类病原菌，其中蛳鱼诺卡氏菌和海豚链 球菌属于革兰氏阳性菌，而哈维弧菌属于革兰氏性阴菌。这三种菌在海洋环境及水产养殖 环境中广泛分布，可通过饵料、水环境等进行传播，它们在生物学特性和致病性上有一定区 另IJ，但都可导致多种水产养殖动物大量死亡，给水产养殖业造成严重的经济损失。
[0003] 蛳鱼诺卡氏菌在在25~40°C均能生长，最适温度为25~28°C，生长的盐度范围为0 ~4.5%，广泛分布于空气、土壤、海水、淡水、腐烂的植被及动物的排泄物中，以腐生为主。 当养殖鱼类体质虚弱、免疫力低下时，通过消化道、鳃或创伤而感染。该病最危险的特点是 潜伏期长，自然发病率15%~60%，诺卡氏菌生长缓慢，但受感染的鱼在发病初期通常未出 现外部症状或症状不明显，故给该病的早期检测、诊断及治疗带来了极大困难。
[0004] 哈维弧菌主要存在于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中，是石斑鱼、东方 飩、輓鱼、鲈鱼、大黄鱼和卵形鲳鰺等多种鱼类的重要病原菌。此外，哈维弧菌还能感染人 类，引起继发性败血症。被感染的鱼类因种类、体质、部位等不同而表现出复杂多样的症状， 且引起较高的死亡率，给水产养殖业造成了严重的经济损失，在养殖生产中亟需快速准确、 操作简便的针对哈维弧菌的检测技术。
[0005] 海豚链球菌是危害世界养殖业的重要病原菌之一，可感染包括淡水河海水在内的 多种野生或养殖鱼类，近年来，陆续有关于海豚链球菌引起哺乳动物甚至人类的疾病报道。 链球菌感染鱼的主要临床症状为眼球突出，角膜混浊，游动异常，并伴有脑膜炎、组织出血 及肝胆症状等解剖病变，但一些鱼类感染海豚链球菌却不表现出症状。在疾病爆发后的幸 存鱼体内也可分离到该病原，这些幸存鱼很可能成为未来疾病爆发的携带者。因此，病原的 早期检测与及时采取有效的防控措施尤为重要。
[0006] 基于现有的技术检测水产动物致病菌大多采用病样细菌分离、培养及鉴定等方 法，其操作过程复杂、耗时，且检测的灵敏度较低，结果不确定常延误病情的诊断。在应对突 发的疾病发生事件时则不能满足诊断及时、灵敏度和特异性高、检测结果准确以及样品数 量较大的要求。针对蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的快速检测方面，国内外学者已 构建针对单一致病菌的细菌培养鉴定和PCR等检测方法，然而在海水水生动物养殖过程中， 进行相关疾病的预防和控制时，其样本量大，时间紧，需要对多种致病菌进行同时快速检 测，而采用单一的致病菌PCR检测方法或一般的细菌分离方法则不能满足上述要求。三重 PCR是在普通PCR的基础上，在同一反应体系中加入三对引物，同时特异性扩增出三种目的 基因片段。在本发明中，在同一反应管内蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的基因片 段，将大大节省时间和试剂，节约经费，为检测提供更多更准确的信息。
[0007] 多重PCR以其快速、高效、灵敏和特性的特点，在病原微生物检测中具有重要作用， 也符合卫生、质检等快速检测的需要，是一种准确、科学、可靠的检测方法。有鉴于此，开发 一种同时检测蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的多重PCR势在必行，对于加强水产养 殖过程中病原的监测和预警、水产品中致病菌的快速检验检疫等具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 针对上述不足，本发明的目的是提供一种能同时检测蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和 海豚链球菌的检测引物组，试剂盒及其方法，该试剂盒精确度高、检测方便。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供的前一技术方案是这样的：
[0010] -种蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测引物组，其特征在于，包括引物 对Ns-mce、引物对Vh-tox和引物对Si-its;其中，所述引物对Ns-mce包括核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的Ns-mceF和核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示的他-1^61?;所述引物对￥114(?包 括核苷酸序列如SEQIDN0.3所示的Vh-toxF和核苷酸序列如SEQIDN0.4所示的Vh-toxR ; 所述引物对Si-its包括核苷酸序列如SEQIDN0.5所示的Si-itsF和核苷酸序列如SEQID
[0011] 本发明提供的另一个技术方案，是提供含有上述的蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海 豚链球菌的检测引物组的试剂盒。
[0012] 进一步的，上述的蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，还包括蛋 白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70%的乙醇、TE缓冲液、 CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCR DsMix。
[0013] 进一步的，上述的蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述酚-氯仿-异戊醇混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
[0014] 进一步的，上述的蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述CTAB 的NaCl溶液为将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1: 20 〇
[0015] 进一步的，上述的蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述阳性 对照品包括蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的DNA模板。
[0016] 进一步的，上述蛳鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述检测引 物组中的引物浓度均为1 〇μΜ。
[0017] 本发明的最后一个技术方案是提供所述检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步 骤：
[0018] 1)取待检测样品50~100mg并加入500-550yL的ΤΕ缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆 后，于12000r/min 离心 lOmin;
[0019] 2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；
[0020] 3)向步骤2)上清溶液中加入30yL质量浓度为10%SDS和15yL 20mg/mL的蛋白酶K， 并于37°C温育lh;
[0021] 4)向步骤3)温育后的溶液中加入100yL 5mo 1/L的NaCl溶液，充分混匀后再加入80 μΙΧΤΑΒ 的 NaCl 溶液，65°C 温育 20min;
[0022] 5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合 溶液混勾，12000g/min离心4_5min;
[0023] 6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇， 12000g/min 离心 4_5min;
[0024] 7)步骤6)离心后去上清，沉淀用lmL的体积浓度为70%的乙醇洗涤后，12000g/min 离心 4_5min;
[0025] 8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50yL TE缓冲液，即为 样品DNA模板；
[0026] 9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5yL 2XPCR DsMix、1.0yL引物Ns-mceF、1.0y L引物Ns-mceR、0 · 7yL引物Vh-toxF、0 · 7yL引物Vh-toxR、1 · 8yL引物Si-itsF、1 · 8yL引物Si-itsR、3. OyL步骤8)得到的样品DNA模板和2.5yL无菌水；
[0027] 10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5yL 2XPCR DsMix、1.0yL引物化-mceF、1 · OyL 引物 Ns-mceR、0 · 7yL 引物Vh-toxF、0 · 7yL 引物Vh-toxR、1 · 8yL 引物Si-i tsF、1 · 8μ L引物Si-itsR、3. OyL阳性对照品和2.5yL无菌水；
[0028] 11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min 离心l〇s，置于PCR仪中，分别于94°C预变性4min，94°C变性3〇8、58°(：退火3〇8、72°(：延伸 lmin，35个循环，72 °C延伸1 Omin，进行PCR反应；
[0029] 12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比 孔;所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5yL与6 X Loading Buff er lyL混合，加入到 1 %琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5yL与6 X Loading Buffer lyL混合，加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5yL DL2000DNA Marker加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中；以120V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和 所述参比孔进行电泳25min后，于凝胶成像系统下观察结果;若样品孔电泳条带出现与阳性 对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。
[0030] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0031] 1、本发明引物组具有高特异性，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与 否，从而能够确定样品是否含有蛳鱼诺卡氏菌、哈维