一种球毛壳菌LJ‑S2L1菌株及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种球毛壳菌lj-s2l1菌株及其应用。

背景技术：

枯萎病是近年来辣椒生产上发生严重的一类土传病害，其致病菌尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)不仅寄主范围广泛，而且能在土壤中长期生存为害。随着辣椒种植面积的扩大和复种指数的提高，辣椒枯萎病菌在田间逐年积累和蔓延，造成此病的普遍发生，严重时可减产70％～80％。不仅如此，枯萎病的发生使得辣椒植株本身病变后免疫减弱，使得其他土传病原菌更加容易入侵，发病严重时甚至导致全田辣椒枯萎死亡。

目前以化学药剂为主的防治方法侧重于发病后治理，不能从根本上控制其危害，且药剂过多使用产生的农药残留和病原抗药性问题严重。随着人们对环境保护、生态平衡、食品安全的重视，传统的化学防治方法弊端愈加突出。生物防治作为能够改善土壤环境，安全环保地控制病害发生的有效途径之一而日益受到关注，且生防菌剂与有机肥混制而成的生物肥由于其防病和增肥的双重功效逐渐成为生防菌应用研究方面的主要形式。也符合国家提出的减少化学农药与肥料用量的“两减”政策。

目前，生物防治枯萎病的方法主要包括植物提取物进行土壤消毒处理及利用生防真菌或生防细菌防治。例如，目前已报道在十字花科植物中提取的辣根素可以在一定程度上替代溴甲烷一类土壤熏蒸剂，以及国内外已经报道的用于防治枯萎病的生防真菌资源如木霉菌(trichodermaspp.)、链霉菌(streptomycesspp.)、菌根菌(mycorrhiza)、青霉菌(penicilliumspp.)及粘帚霉(gliocladiumspp.)等，以及生防细菌资源如荧光假单孢菌(psdeuomnodafluoerncnet)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、粘质沙雷菌(serratiamarcescens)等。从国内针对枯萎病的研究报道来看，常见瓜类枯萎病的生物防治研究较多，而对辣椒枯萎病的相关研究却很少。到2014年为止国内已经登记的376种微生物农药有中，也少有专门针对辣椒枯萎病的生防菌剂。且目前生防菌筛选途径大多集中在根际土及内生菌等资源中，利用粪生菌适生特点筛选生防菌应用于生物肥研究的报道还相对较少。

毛壳菌属(chaetomium)真菌因能腐生于土壤、动物粪便、植物残体等上，并能产生丰富的降解纤维素的酶和具有生理活性的次生代谢产物，且多对植物无毒害作用而被认为是具有潜在生物防治能力的类群。但目前研究的拮抗毛壳菌种类较少，两株球毛壳菌虽已分离获得并被用于防治人参和苹果的真菌病害，中国专利：cn104694397a、cn104877919a，但是均未涉及分离自田间施用的农家肥中，也未报道对辣椒枯萎病及其他危害辣椒根部的土传病害有防治作用。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种球毛壳菌lj-s2l1菌株及其应用，它抗菌效果较好，对辣椒枯萎病病原真菌抑制率高，其发酵液及菌体均对尖孢镰刀菌辣椒致病型有效，可作为辣椒枯萎病的生物防治菌剂使用，且培养要求简单，成本低廉。

本发明是这样实现的：球毛壳菌lj-s2l1菌株，该菌株的保藏编号为cctccm2016649。

球毛壳菌lj-s2l1菌株在防治辣椒枯萎病中的应用。

包括该菌株的发酵液与菌体在防治辣椒枯萎病中的应用。

本发明的球毛壳菌lj-s2l1菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc，地址：中国武汉武汉大学；邮编:430072)，其保藏编号是cctccm2016649，保藏日期为2016年11月17日，分类命名为球毛壳菌，拉丁文学名为chaetomiumglobosum。

与现有技术相比，本发明培养要求简单，生长条件易控制且产率大，其抗菌效果较好，对辣椒枯萎病病原菌菌丝有吸附、消解的作用，且对毒力测定结果表明，菌株s2l1发酵液对辣椒枯萎病菌的抑制率在1000μl/ml时可以达到72.10％，抑制中浓度为300.63μl/ml；盆栽试验防效能达到71.8％，与80％多菌灵500倍液效果相当。该菌株在辣椒枯萎病的防治方面有广阔的应用前景，其发酵液和无菌发酵滤液均有很强的抑制作用，且适生于农家肥，可作为辣椒枯萎病的生防菌剂单独使用或复配于有机肥形成生物肥使用。

附图说明

图1是本发明菌株在分离培养基上的培养特征；

图2是本发明的生防菌株形态特征；

图3是本发明菌株的its序列分析的系统发育进化树；

图4是本发明菌株对辣椒枯萎病病原真菌的抑制效果；

图5是本发明菌株对辣椒枯萎病病原真菌菌丝的吸附作用；

lj-s2l1作用尖孢镰刀菌的消解、断裂菌丝(3d)；菌丝a为拮抗菌，菌丝p为病原菌；

图6是本发明菌株发酵液对辣椒枯萎病病原菌的抑制效果；

图7为是否灭菌对不同浓度发酵液处理比较结果。

具体实施方式

本发明的实施例1：球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株的筛选：选择辣椒枯萎病严重发生之后连续两年以上施用农家肥的辣椒地块，在农家肥腐熟后施用的第7d，利用五点法采集健康植株的根际粪土。然后利用稀释分离法，每个土样称取10g放入装有灭菌的玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，160r/min振荡30min得到10^-1样品悬液。在无菌环境下将土样悬液用无菌水依次稀释成10^-2、10^-3、10^-4及10^-5个不同浓度。取后三个浓度的土壤悬浮液0.1ml分散滴于pda平板上，用灭菌的三角玻璃棒涂匀，静置20min后放到25℃黑暗条件下倒置培养，每天观察，一旦有菌落形成立即纯化并保存。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)配方为：马铃薯200g去皮切块煮20min后，用纱布过滤收集滤液，加入葡萄糖20g，琼脂17g，融化混匀后定容至1000ml，自然ph，121℃，高压灭菌20min备用。

菌种鉴定

(1)形态观察：该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)平板上25℃培养时最初菌落呈浅黄色，气生菌丝生长茂盛、呈棉絮状，菌丝浅黄色，具明显隔膜。菌落生长到后期颜色变深，能附着产生大量黑色子囊果，用1％葡萄糖溶液制成菌悬液临时装片后显微观察其特征为卵圆形，黑褐色，直径160-270μm，周生较多附属丝。子囊孢子褐色，柠檬形，两端突起，少数椭圆形，8-11μm×6-8μm。

(2)its序列分析及系统发育树的构建：pda平板活化菌株lj-s2l1，待菌落铺满培养皿后，用灭菌刀片刮取菌组织，采用2％ctab法提取基因组dna，用真菌通用引物：its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)对提取的dna进行pcr扩增^[12]。pcr反应体系(25μl)：2×estaqmastermix(北京天根生物技术有限公司)12.5μl、dna模板1μl、通用引物its1和its4各1μl、ddh2o9.5μl，对照加入ddh2o代替dna模板。pcr扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工公司测序。lj-s2l1菌株its序列与genbank相近似真菌的its序列(表1)一起用于分子系统发育学分析。通过clustal-x1.81^[13]软件包进行相似序列的比对，再运用bioeditversion5.0.6(tomhall,departmentofmicrobiology,northcarolinastateuniversity,raleigh,nc27695)对比对的结果进行手工校正，把上述处理的序列数据通过paup*4.0beta10进行分子系统发育分析，构建系统发育树。

通过最大简约法分析(maximumparsimonyanalysis)建立最大简约树，应用启发式搜索法(heuristicsearch)作为获得聚类树的方法，应用树二等分再连接法(tree-bisection-reconnection,tbr)作为启发式搜索的算法。在系统进化分析中碱基序列间空缺(gaps)作为碱基缺失处理，把所有碱基状态处理为无序并且不加权(equalweight)。通过1000步重复获得的自展检验(bootstrap)数值标记在分支上。

本发明菌株编号lj-s2l1，分类命名为：球毛壳菌chaetomiumglobosum，结果见图1-3。

本发明的实施例2：粪生球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株对辣椒枯萎病病原的抑制作用

采用平板对峙法筛选生防菌并测定抑制率：用打孔器分别打取直径为5mm的靶标病原菌与待测菌菌饼，将两菌饼相距5.5cm分别接于同一pda平板的两侧，每组三次重复，以不接待测菌为对照，置于25℃培养7d，测量病原菌朝向待测菌的菌落半径，计算待测菌的抑制率。挑选出对辣椒枯萎病病原菌有明显抑制作用的菌株进行复筛。生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径/对照菌落直径-5mm)×100。

抑菌圈法验证：用无菌水洗脱试管斜面中培养了5d的尖孢镰刀菌制成1×10⁶个/ml的孢悬液，然后吸取5ml加入150ml冷却至50℃左右的pda培养基中，倒平板备用，然后将初筛有抑制效果菌株的5mm菌饼接入平板中央，放于25℃箱中黑暗倒置培养。5d后观察并记录抑菌圈直径。

结果如表1和图4、5所示，从辣椒根际农家肥分离到的76株真菌中，共筛选出对辣椒枯萎病菌有拮抗作用的菌株13株，其中抑菌率超过50％的菌株有5个，效果最好的菌株标记为lj-s2l1(表1)，其抑制率可达到71.67％，复筛试验产生的抑菌圈直径第5d时也能达到32mm。在lj-s2l1菌株与尖孢镰刀菌对峙培养第3d的两菌株交界处，显微观察发现，尖孢镰刀菌丝出现隘缩、弯曲、部分膨大甚至断裂的现象。

表1球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株对辣椒枯萎病菌的抑制作用

注:表中数据为平均值±标准差。同列数据后不同小写字母表示经duncan新复极差法检验在p＜0.05水平差异显著。

本发明的实施例3：球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株发酵液对辣椒枯萎病病原的抑制作用

发酵液制备：将活化好的菌株lj-s2l1接种到pdb培养基中，25℃160r/min培养7d后，用双层无菌纱布过滤菌液，然后把滤液放入10000r/min的离心机离心3min，得到的上清液分为两份，一份经过高压灭菌处理，另一份不做任何处理。以辣椒枯萎病菌为指示菌，用下列两种方法测定菌株lj-s2l1两种发酵液的抑菌特性。

菌落直径法：将菌株lj-s2l1的两种发酵液分别按体积1﹕4的比例加入冷却至50℃左右的pda培养基，混匀制成含生防菌发酵液的平板，随后在平板中央接种直径5mm的病原真菌菌饼，置于25℃下黑暗暗培养7d。以普通pda平板为对照。用十字交叉法测量病原菌菌落直径，统计时去除菌饼直径，然后计算菌落生长抑制率，每处理设3次重复。菌落生长抑制率方法同实施例2。

纸片扩散法：根据上述菌落直径法中的方法制得lj-s2l1菌株的灭菌发酵液，然后设置浓度梯度为10、20、30、40、50μl分别依次滴于灭菌滤纸片，吹干后放入含有指示菌的平板，25℃下暗培养7d观察记录病原菌菌落直径，然后计算菌落生长抑制率，计算方法同实施例2，每处理设3个重复(夏丽娟等，2014)。

结果如表2所示，菌落直径法测定的lj-s2l1菌株灭菌与未灭菌的发酵液对辣椒枯萎病菌都具有抑制作用。灭菌的lj-s2l1菌株发酵液对尖孢镰刀菌的抑菌率较未灭菌发酵液的抑菌率低，虽两者差异显著，但灭菌发酵液的抑菌率仍然能达到50％以上，指示菌的菌落也明显变薄，菌丝呈溶解状，见图6。

灭菌与未灭菌发酵液的滤纸片在不同浓度的处理间对指示菌抑制效果存在明显差异。含量10μl灭菌发酵液的滤纸片几乎没有产生抑菌圈，含量20μl时开始出现抑制作用，随着滤纸片中灭菌发酵液的浓度增大，抑菌圈直径逐渐增大，浓度为50μl时抑菌圈直径能达到30.3mm。同样，未灭菌发酵液滤纸片的抑菌作用与发酵液浓度呈正相关，浓度为10μl时即开始产生抑菌作用，50μl时抑菌圈最大能达42.5mm，见图7。

表2球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株发酵液对辣椒枯萎病菌的抑制作用

注:表中数据为平均值±标准差。同列数据后不同小写字母表示经duncan新复极差法检验在p＜0.05水平差异显著。

本发明的实施例4：球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株发酵液的室内毒力测定

参照实施例3的方法制备无菌发酵滤液。将无菌滤液与熔化冷却至50℃左右的pda培养基混合，制成菌液含量分别为1000、500、250、125和62.5μl/ml的平板。选用80％多菌灵可湿性粉剂，同上法制成多菌灵含量分别为500、250、125、62.5和31.3μg/ml的含药平板作为对照药剂平板。用pdb液体培养基代替培养液作为对照平板。然后将直径为5mm的辣椒枯萎病菌菌饼接到各平板中央，28℃恒温培养7d后，测量各培养基平板上菌落的直径，计算拮抗菌培养液的抑制能力。抑菌率计算同实施例2，每处理3次重复。采用dps软件和excel统计分析数据。以菌液浓度的对数值为自变量，抑菌率的概率值为因变量，建立毒力回归方程，求出lj-s2l1菌及对照药剂的有效抑制浓度(ec50)。

结果如表3所示，室内毒力测定结果(表3)显示，菌株lj-s2l1灭菌发酵液对辣椒枯萎病菌的ec50为300.63μl/ml，明显高于多菌灵，说明要达到相同抑制率，需用到的lj-s2l1灭菌发酵液原液较多，且其抑菌作用随着用量的增加而加强，pda平板发酵液处理浓度为1000μl/ml时对辣椒枯萎病菌的抑制率最高，达到72.10％。因此本结论也为进一步的有效成分确定与发酵液浓缩提供理论依据。

表3球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株与多菌灵的抑菌效果对比

本发明的实施例5：粪生球毛壳菌chaetomiumglobosumlj-s2l1菌株对辣椒枯萎病的防治效果

首先按实施例3中方法准备菌株lj-s2l1的含菌发酵液，并将孢子浓度调为1×10⁸cfu/ml。准备4～5片真叶的辣椒植株，通过灌施和喷施的方式将lj-s2l1发酵液接种于植株根部土壤周围并将其定植到装有经两次高压湿热灭菌育苗土的花盆中，7d后，通过灌根法接种辣椒枯萎病菌，然后将接种后的辣椒植株放于温度28℃，湿度90％，白天光照，晚上黑暗的气候箱中培养。以无菌水和80％多菌灵500倍液处理为对照，每个处理20株，重复3次，7d后每天观察并记录不同处理辣椒苗的生长与发病情况，并对结果进行统计分析。

结果如表4所示，单接辣椒枯萎病致病菌的无菌水对照处理的病情指数达到71.1％，而接种菌株lj-s2l1及多菌灵的处理病情指数明显降低。从防效上看，菌株lj-s2l1防效能达到71.8％，略低于多菌灵对照的防效，但两者在0.1％水平差异不显著。

表4生防菌株lj-s2l1对辣椒枯萎病的盆栽防治效果

注:表中数据为平均值±标准差。同列数据后不同大、小写字母表示经duncan新复极差法检验在p＜0.1及p＜0.05水平差异显著。

本发明的球毛壳菌lj-s2l1是一株从施有农家肥的的辣椒根际处粪土中分离得到粪生生防菌株，对辣椒枯萎病病菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型(f.oxysporumf.sp.vasinfectum)有较好的抑制作用，且进一步的对峙试验表明其对辣椒其他土传病害也有一定拮抗作用，具体结论待进一步结果分析。结合生防菌株lj-s2l1在农家肥上的适生性，该菌株可作为生物肥研发的优势生防菌。其优点在于菌株的含菌发酵液及无菌发酵液对辣椒枯萎病病原菌均有抑制作用，且培养要求简单，生长条件易控制且产率大。该菌株在辣椒枯萎病的绿色防控方面具有广阔的应用前景。