含有木聚糖酶的动物料添加剂的制作方法

专利名称：：含有木聚糖酶的动物料添加剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及动物饲料添加剂，该添加剂含有一种单组分木聚糖酶，该木聚糖酶源于腐殖霉属(Humicola)的菌株、嗜热子囊菌属(Thermoasous)菌株、毛壳菌属(Chaetomium)菌株、毛霉属(Mucor)菌株、蓝霉菌属(Talaromyces)菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属(Myceliophthora)的菌株、梭孢壳属(Thielavia)菌株、丝衣霉属(Byssochlamus)菌株或拟青霉属(Paecilomyces)菌株。本发明的其它方面涉及单组分木聚糖酶制剂、DNA结构、重组表达载体、宿主细胞、以及生产单组分木聚糖酶制剂的方法。可用作动物饲料的组分的植物原料的种类和数量通常受到动物消化该原料能力的制约。饲料增强酶通常为源于微生物的酶，它能够通过改善饲料的可消化性而提高其利用效率。木聚糖分解酶(EC3.2.1.8)是众所周知的饲料增强酶。曾报导过获自芽胞杆菌属(Bacillus)菌株、曲霉属(Aspergillus)菌株、木霉属(Trichoderma)菌株、枝顶孢属(Acremonium)菌株的木聚糖酶。另外，一种通过Humicolainsolens的深层发酵而获得的一种酶制剂已经商品化(Bio-FeedTMPlus，由NovoNordisKA/S出售，Denmark)。已报导了获自真菌疏绵状高温霉(Thermomyceslanuginosus)(同Humicolalanuginosa)的木聚糖酶制剂〔参见LischnigT，PurkarthoferH和SteinerW；BiotechnologyLetters199315(4)411-414；GomesJ，PurkarthoferH，HaynM，KapplmüllerJ，SinnerM，和SteinerW，Appl.Microbiol.Biotechnol.1993，39，700-707〕。但是，从未披露过将疏绵状高温霉木聚糖酶用作饲料增强酶。另外，现有技术中所披露的木聚糖酶制剂均涉及含有多种酶组分的复合酶制剂。也未见利用重组DNA技术由高温霉属获得单组分木聚糖酶制剂的报导。对于很多种应用来说，复合酶制剂的使用被认为是有益的，因为多种组分的共同作用可产生协同作用。对于某些用途来说，例如，木素纤维素转化成液体贮存物或燃料，食品加工，特别是对于提高动物饲料的可消化性而言，木聚糖分解酶和纤维素分解酶的混合物被认为具有最佳性能(AlamM，GomesI，MohiuddinG，&HoqMM；EnzymeMicrob.Technol.1994，16，298-302)。根据本发明，业已发现源于疏绵状高温霉的木聚糖酶与常规饲料增强酶相比，是一种优良的饲料增强酶，当将其加入动物饲料中时可明显改善饲料的可利用性。此外，由于源于疏绵状高温霉的木聚糖酶制剂具有良好的热稳定性，特别适于在防止微生物感染，特别是沙门氏菌(Salmonella)感染的条件下将其加工成饲料添加剂。还发现，源于疏绵状高温霉的木聚糖酶能显著降低消化物粘度，这表明在鸡饲料的转化效率方面有明显改善。最后，我们惊奇地发现，重组生产的高温霉属木聚糖酶的热稳定性明显高于天然木聚糖酶的，这使得重组生产的木聚糖酶特别适于在防止微生物感染，特别是沙门氏菌感染的条件下被加工成饲料添加剂。因此，本发明的目的是提供一种单组分木聚糖酶制剂，该木聚糖酶组分是通过重组DNA技术从高温霉属或相关属的菌株获得的。因此，本发明的第一方面提供了一种动物饲料添加剂，该添加剂含有一种单组分木聚糖酶，该木聚糖酶源于腐质霉属的菌株、嗜热子囊菌属的菌株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株、丝衣霉属菌株或拟青霉属菌株。另一方面，本发明提供了一种单组分木聚糖酶制剂，在该制剂中，所述木聚糖酶组分源于腐殖霉属菌株、嗜热子囊菌属株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株、丝衣霉属菌株或拟青霉属菌株。再一方面，本发明涉及一种含有编码一种木聚糖酶组分的DNA序列的DNA结构，该DNA序列包括a)序列1所示的DNA序列的木聚糖酶编码部分，或可从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株DSM10133里的质粒获得的DNA序列；或b)一个类似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分、或类似于可从酿酒酵母菌株DSM10133里的质粒获得的DNA序列的DNA序列，该类似的DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分，或同源于可从酿酒酵母菌株DSM10133里的质粒获得的DNA序列；或ii)能与和序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分相同的寡核苷酸探针杂交，或与可从酿酒酵母菌株DSM10133里的质粒获得的DNA序列杂交；或iii)能编码一种多肽，该多肽与由序列1所示的DNA序列所编码的多肽或可从酿酒酵母菌株DSM10133里的质粒获得的DNA序列同源性至少为70％；iv)能编码一种多肽，该多肽能与抗纯化木聚糖酶的抗体进行免疫反应，该纯化木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株DSM4109、或由序列1所示的DNA序列或可从酿酒酵母菌株DSM10133里的质粒获得的DNA序列编码。又一方面，本发明涉及一种具有本发明DNA结构的表达载体，一种含有该DNA结构或表达载体的宿主细胞，和一种生产本发明单组分木聚糖酶制剂的方法，该方法包括在能产生所述木聚糖酶的条件下培养所述宿主细胞，并从培养物中回收所述木聚糖酶。将结合附图对本发明作进一步说明，其中图1表示在30℃下，在pH2.5-9的范围内测得的本发明单组分木聚糖酶的相对木聚糖分解活性(％)。它表明该酶的最佳pH范围为4.5-7.5，尤其是在5.0-6.5的范围内，在pH6左右；图2表示在pH5.5和30-80℃的温度范围内测得的本发明单组分木聚糖酶的相对木聚糖分解活性。图中显示该酶的最佳温度范围为50-70℃，在60℃左右；图3表示本发明单组分木聚糖酶制剂(I)的相对残余活性(％)与天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂(II)的相对残余活性(％)的比较。残余活性是在pH6.0和温度分别为60、65、70和75℃的条件下测得；图4表示天然疏绵状高温霉木聚糖酶(·)与通过培养Humicolainsolens所获得的多组分酶制剂(×)对小麦粘度降低的效率的比较结果(样品中剂量(FXU/g小麦))；图5表示重组生产的单组分疏绵状高温霉木聚糖霉(I)与天然疏绵状高温霉木聚糖酶(II)的小麦粘度降低效率的比较结果(样品中剂量(FXU/g小麦))；图6表示作为木聚糖酶加入量(FXU/kg饲料)函数的小麦AMEn值(MJ/kg)；(A)疏绵状高温霉单组分木聚糖酶制剂；(B)天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂；(C)参比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一种产品，Denmark；通过培养Humicolainsolens而获得的一种多组分酶制剂)；和图7以木聚糖酶加入量(FXU/kg饲料)的函数形式表示实验食物中脂肪消化率(％)；(A)疏绵状高温霉单组分木聚糖酶制剂；(B)天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂；(C)参比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一种产品，Denmark；通过培养Humicolainsolens而获得的一种多组分酶制剂)。动物饲料添加剂当把饲料增强酶加入动物饲料中时，其可以改善对植物细胞壁的体内分解能力，部分原因是，其可以降低肠道粘度(Bedford等，Proceedingsofthe1stSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition，1993，pp.73-77)，从而实现动物对植物养分的较好利用。从而改善了动物的生长速度和/或饲料转化率(即摄入的饲料重量与体重增加之比)。在本文中，动物饲料添加剂是一种酶制剂，它含有一种或几种饲料增强酶，以及合适的载体和/或赋形剂，该酶制剂以适于加入动物饲料中的形式提供。本发明的动物饲料添加剂可以用本领域公知的方法制备，可以制成干燥或液体制剂形式。对于待加入所述制剂中的酶来说，可选择性地用本领域公知的方法进行稳定化。在本文中，一种含有单组分木聚糖酶的动物饲料添加剂是以一种适于加入动物饲料中的形式提供的酶制剂，在该酶制剂中，基本上所有的木聚糖分解活性(即可检测到的木聚糖分解活性)是由一种单一的木聚糖酶组分产生的。本发明的动物饲料添加剂可以是一种颗粒化的酶制品，它可以与饲料组分方便地混合，或者，更理想的是形成一种预混组分。所述颗粒化酶制品可以是包衣的或非包衣的。理想的是，酶颗粒的粒度与饲料和预混组分的粒度相当。这样可以为将酶掺入饲料中提供一种安全而又方便的方式。另外，本发明的动物饲料添加剂可以是一种稳定化液体组合物，它可以是一种水基或油基浆体。本发明的动物饲料添加剂可以在体外(通过对饲料组分改性)或体内发挥其作用。本发明的饲料添加剂特别适于加入含有大量阿拉伯糖基木聚糖和葡糖醛木聚糖的动物饲料组合物中，如含有诸如大麦、小麦、黑麦或燕麦或玉米之类的谷物的饲料。单组分木聚糖酶制剂本发明提供了一种动物饲料添加剂，该添加剂含有一种单组分木聚糖酶，该木聚糖酶源于腐殖霉属菌株、嗜热子囊菌属菌株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株、丝衣霉属菌株或拟青霉属菌株。在一种优选实施方案中，本发明的动物饲料添加剂含有一种单组分木聚糖酶，该酶源于一种高温霉属菌株，特别是一种疏绵状高温霉菌株，最好是疏绵状高温霉菌株DSM4109，或该菌株的突变体或突变型。在一种更具体的实施方案中，所述木聚糖酶是有相同于或部分相同于(即至少部分相同于)一种纯化木聚糖酶的免疫化学特性，所述纯化木聚糖酶或a)源于疏绵状高温霉菌株DSM4109；或b)由序列1所示的DNA序列的木聚糖酶编码部分编码；或c)由可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。理想的是，所述单组分木聚糖酶是源于一种携带一个编码该木聚糖酶组分的基因的宿主细胞。具体地讲，所述单组分木聚糖酶可以是a)由序列1所示的DNA序列编码，或由可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码；或b)由一个类似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分的DNA序列或类似于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的DNA序列编码，该类似的DNA序列或i)与序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分同源，或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列同源；或ii)能与和序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分相同的寡核苷酸探针杂交，或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列杂交；或iii)能编码一种多肽，这种多肽与由序列1所示DNA序列编码的多肽的同源性或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的同源性至少为70％；或iv)能编码一种多肽，该多肽能与一种抗纯化的木聚糖酶抗体进行免疫反应，该纯化木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株DSM4109，或由序列1所示DNA序列或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。在更好的优选实施方案中，所述单组分木聚糖酶还具有以下特征a)在pH6.0和60℃温度下温育60分钟后，其残余酶活性高于96％；b)在pH6.0和65℃温度下温育60分钟后，其残余酶活性高于83％；c)在pH6.0和70℃温度下温育60分钟后，其残余酶活性高于20％；和/或d)在pH6.0和75℃温度下温育60分钟后，其残余酶活性高于10％。类似的DNA序列在本文中，类似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分的DNA序列是指编码一种木聚糖分解酶的任何DNA序列，该酶具有上文(i)-(iv)所述特征中的一种或几种。理想的是，所述类似的DNA序列可从其它的或相关的(如相同的)能产生木聚糖酶组分的生物中提取，所提取的序列基于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或其合适的序列(如20-500bp)，例如可以用本文所述的方法进行提取，而且，所述类似序列可以是含有本文所示DNA序列的等位突变型或种突变型。另外，可以根据序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或其任何亚序列构建所述类似的DNA序列，例如，通过引入核苷酸置换，这种置换不会产生由所述DNA序列所编码的另一种木聚糖分解酶的氨基酸序列，但它相关于用于生产这种酶的宿主生物的密码子使用，或者通过引入能产生不同氨基酸序列的核苷酸置换。当进行核苷酸置换时，氨基酸的变化最好是微不足道的，即保守的氨基酸置换，不会对蛋白的折叠或活性造成明显影响，小的缺失，一般为1-大约30个氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，如一个氨基末端蛋氨酸残基，一个最多为约20-25个残基的小的连接肽，一个有利于提纯的小的延伸部分，如一个聚组氨酸片段、一个抗原表位或一个结合域。保守置换的例子是在碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)组内进行置换。关于核苷酸置换的一般性描述，参见Ford等，ProteinExpressionandPurification，2，1991，95-107。本领域技术人员十分清楚的是，上述置换可以在对该分子功能很关键的部分以外进行，因此，仍然能得到活性木聚糖分解酶。最好不要对由本发明DNA结构编码的木聚糖酶的活性所必需的氨基酸进行置换，这些氨基酸可以按照本领域公知的方法进行确定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，参见CunninghamandWells，Science，1989，244，1081-1085)。在后一种技术中，将突变引入分子的每一个残基，并测定所得突变型分子的生物学(即蛋白分解)活性，以确定对该分子的活性关键的氨基酸。通过分析晶体结构可以测定底物-酶互作位点，如通过诸如核磁共振分析技术、晶体学技术或光亲和标记技术(例如，参见deVos等，Science1992，255，306-312；Smith等，J.Mol.Biol.1992，224，899-904；Wlodaver等，FEBSLett.1992，309，59-64)进行测定。可以理解，序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或其任何亚序列，均可用作分离编码木聚糖分解酶的完整DNA序列，如序列1所示DNA序列的探针。在上文i)所提及的同源性是以两种序列之间的相同程度来确定的，表示第一个序列是由第二个序列衍生而来。理想的是，用本领域已知的计算机程序，如在GCG程序包里所提供的GAP进行测定(NeedlemanSB&WunschCD；J.Mol.Biol.1970，48，443-453)。利用GAP及以下参数进行DNA序列比较GAP产生损失5.0，GAP延伸损失0.3，该DNA序列的编码部分与序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的相同程度以至少70％为宜，特别是至少为80％、至少85％、至少90％或者至少为95％。上文(ii)部分所提及的杂交是指在某种特定条件下，所述类似的DNA序列能与和编码木聚糖酶组分的DNA序列相同的寡核苷酸探针杂交，杂交条件在下文的材料和方法部分将作详细说明。所采用的探针可以序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或其能编码该酶的至少6-7个氨基酸的亚序列为基础或以序列2所示的推定氨基酸序列为基础方便地进行构建。在后一种情形下，所述探针是由一种相当于大量低简并密码子的氨基酸亚序列制备的。通常，类似的DNA序列与所述DNA序列高度同源，如与编码本发明木聚糖酶组分的序列1所示序列的同源性至少为70％，以至少80％为宜，尤其是至少85％、至少90％、或者甚至与序列1所示序列的同源性至少为95％。在上文(iii)部分所提及的同源程度是以两种序列间的相同程度进行确定的，它表示第一种序列由第二种序列衍生而来。理想的是，用本领域已知的计算机程序，如在GCG程序包里所提供的GAP进行测定(NeedlemanSB&WunschCD；J.Mol.Biol.，1970，48，443-453)。利用GAP及以下参数进行多肽序列比较GAP产生损失3.0，GAP延伸损失0.1，由一种类似的DNA序列编码的多肽与由含有序列1所示DNA序列的编码部分的DNA结构或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码的酶的同源性以70％为宜，尤其是至少为80％，至少为85％，甚至至少为90％。按照本发明上述方法，本发明木聚糖酶与大多数已有木聚糖酶的DNA同源性是用计算机程序GAP测定的。本发明木聚糖酶与获自Trichodermareessi的木聚糖酶I的DNA同源性仅为63％(TorronenA等，Biotechnology1992，10，11，1461-1465)，而与源于碳黑旋孢腔菌(Cochlioboluscarbonum)的木聚糖酶I的DNA同源性为63％(ApelPC等；Mol.PlantMicrob.Interact.，1993，6，467-473)。上文特征(iv)所提及的“源于”不仅是指由疏绵状高温霉菌株DSM4109所产生的木聚糖酶组分，而且还指由从该菌株中提取的DNA序列编码并在由该DNA序列转化的宿主细胞中产生的木聚糖酶组分。免疫反应性可以用在下文的材料和方法部分所述的方法测定。饲料增强酶在另一种优选实施方案中，本发明的饲料添加剂可以包括额外的饲料增强酶。在本发明的内容中，饲料增强酶包括，但不限于α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，特别是乳糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶，特别是内-β-1，4-葡聚糖酶和内-β-1，3(4)-葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，特别是阿拉伯半乳聚糖内-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内-1，3-β-半乳糖苷酸、内葡聚糖酶，特别是内-1，2-β-葡聚糖酶、内-1，3-α-葡聚糖酶、和内-1，3-β-葡聚糖酶、果胶降解酶，特别是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酶、阿聚糖酶、鼠李半乳糖醛酶、鼠李半乳糖醛乙酰脂酶、鼠李半乳糖醛-α-鼠李糖苷酶、果糖酸盐裂解酶、和α-半乳糖醛酸苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶和脂解酶，如脂肪酶和角质酶。微生物源本发明涉及一种动物饲料添加剂，该添加剂包括一种木聚糖酶，该酶源于属于嗜热真菌类的菌株，即高温霉属或相关的属。高温霉属包括几个种〔Appinis&Eggins；1966〕，特别是疏绵状高温霉(同疏绵状腐质霉)的种，这些种通常与嗜热真菌类相关[Cooney&Emerson；1964]。有几个属属于这一类型，例如，业已证实腐质霉属、嗜热子囊菌属、毛壳菌属、毛霉属、蓝霉菌属、Malbranchea属、毁丝霉属、梭孢壳属的种是很有潜力的酶生产菌。而且，丝衣霉属和拟青霉属也与这一类型相关。一般认为高温霉属的分类关系不确定。不过，theNationalInstituteofHealthdatabaseEntrez(最近为1996年1月)将高温霉属分类为有丝分裂核菌类(Pyrenomycete)(即一种仅对其做过不全面鉴定的核菌，缺乏足够的资料将其与具体的目或具体的科联系在一起)。最近的分子研究试图阐明高温霉属的18S-RNA的序列，以便利用该资料进一步澄清该属的系统发育关系。对现有资料的暂时的解释表明，高温霉属与不整囊菌纲(Plectomycetes)下面的真菌类，特别是散囊菌目(Erotiales)密切相关。通过对数据库所做的同源性分析发现，丝衣霉属18S-RNA的序列与所公开的疏绵状高温霉的序列最为相关(NovoNordisk1996，资料未发表)。如果对属于高温霉属的分离种群所作的研究支持最初的发现，则有理由将高温霉属转移到不整囊菌的目下面。因此，本发明还涉及源于不整囊菌纲、特别是散囊菌目的木聚糖酶制剂。对本发明的木聚糖酶的核苷酸和蛋白的资料进行了同源性分析。同源性分析表明，最相关的木聚糖酶是源于Trichodermareesei的木聚糖酶I和源于碳黑旋胞腔菌的木聚糖酶I。两种木聚糖酶均属于糖基水解酶的家族II(HenrissatB；Biochem.J.1991，280，309-316)，这表明，本发明的木聚糖酶也属于该科。已对疏绵状高温霉的几种样品进行了保藏，并要从被布达佩斯条约所认可的国际保藏机构公开获得，这些保藏机构如美国模式培养物保藏所(ATCC)，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，USA。已根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约将疏绵状高温霉属菌株保存在德国微生物和培养物保藏所(DSM)，MascheroderWeg16，DE-3300Braunschweig，Germany，保存日为1987年5月4日，保藏号为DSM4109。已根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约将酿酒酵母菌株DSM10133保存在德国微生物和培养物保藏所(DSM)，MascheroderWeg1b，DE-3300Braunschweig，Germany，保存日为1995年7月19日，保藏号为DSM10133。该菌株含有包括序列1所示全长DNA序列的质粒DNA，该DNA编码本发明的内切葡聚糖酶，并结合在酵母载体pYES2.0上。DNA结构另一方面，本发明提供了一种含有编码一种木聚糖酶组分的DNA序列的DNA结构，该DNA序列包括a)序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分，或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列；或b)一个类似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分的DNA序列，或类似于可从酿酒酵母菌株10133中的质粒获得的DNA序列的DNA序列，该类似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分，或同源于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列；或ii)能与和序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分相同的寡核苷酸探针杂交，或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列杂交；或iii)能编码一种多肽，该多肽与由序列1所示的DNA序列编码的多肽或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的同源性至少为70％；或iv)能编码一种多肽，该多肽能与抗纯化木聚糖酶的抗体进行免疫反应，所述纯化木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。在本文中，“DNA结构”是指来源于cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA的任何核酸分子。“结构”一词是指单链或双链核酸片段，它可以是以完整的或部分天然存在的编码感兴趣的木聚糖酶的核苷酸序列为基础。所述结构可选择性地含有其它核酸片段。本发明的编码木聚糖分解酶的DNA结构以来源于基因组DNA或cDNA为宜，例如，可以用标准技术(例如，参见Sambrook等，MolecularCloning.ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)获得这种DNA结构制备基因组或cDNA文库，并用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码全部或部分木聚糖分解酶的DNA序列。也可以用已建立的标准方法合成本发明编码木聚糖分解酶的核酸结构，例如，由Beaucage和Caruthers所披露的亚磷酰胺法(TetrahedronLetters，1981，22，1859-1869)，或由Matthes等所披露的方法(EMBOJournal，1984，3，801-805)。按照亚磷酰胺法，在诸如自动DNA合成仪之类的仪器上合成寡核苷酸，纯化、退火、连接并克隆到合适的载体上。另外，所述核酸结构可以是按照标准技术通过连接合成的、基因组或cDNA来源的片段(合适的话)、相当于完整核酸结构的各部分的片段而制成的混合的合成和基因组结构、混合的合成和eDNA结构、或混合的基因组和cDNA结构。所述核酸结构还可以用特殊的引物通过聚合酶链式反应制成，例如，在US4,683,202中披露的或由Saiki等(Science1988，239，487-491)所披露的方法进行。编码木聚糖酶组分的DNA序列可源于腐质霉菌株、嗜热子囊菌属菌株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株或拟青霉属菌株。在一种优选实施方案中，编码木聚糖酶组分的DNA序列源于高温霉属菌株，特别是疏绵状高温霉菌株。在一种最佳实施方案中，所述DNA序列源于或者是由疏绵状高温霉的DNA文库或其突变体或突变型产生。可以用常规方法分离编码木聚糖分解酶的DNA序列，该方法一般包括-将例如源于疏绵状高温霉菌株DSM4109或源于酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒的cDNA文库克隆在一种合适的载体上，-用所述载体转化一种合适的宿主细胞，-在适于表达由所述cDNA文库中的一个或几个克隆编码的目的木聚糖分解酶的条件下培养所述宿主细胞，-通过测定由所述克隆所产生的酶的任何木聚糖酶分解活性筛选阳性克隆，和-从所述克隆中分离编码目的木聚糖酶的DNA。在WO93/11249中披露了一种一般方法，该文献的内容被作为本发明
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。对筛选方法的更详细的说明参见下文的例1。例如，编码一种木聚糖酶组分的DNA序列可以用以下方法分离筛选疏绵状高温霉菌株的一个cDNA文库，和选择表达木聚糖酶的克隆(如，通过该酶水解1，4-β木聚糖中1，4-β-木糖苷连键的能力确定)。然后用标准方法，如例1中所述的方法从该克隆中分离合适的DNA序列。在本文的优选实施方案中，本发明的核酸结构包括序列1所示的DNA序列的木聚糖酶编码部分，或其任何亚序列，但它由于遗传密码的简并而又不同于序列1所示的DNA序列。本发明还包括能在下述条件下与编码序列2所示氨基酸序列或其任何亚序列的核酸分子(基因组、合成的或cDNA或RNA)杂交的核酸序列。重组表达载体另一方面，本发明提供了一种含有本发明DNA结构的重组表达载体。本发明的重组表达载体可以是任何可以方便地用于重组DNA技术的载体，而载体的选择通常取决于该载体有待导入其中的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外的实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。另外，所述载体也可以是这样的当它被导入宿主细胞后，整合到宿主细胞基因组上，并与其所整合的染色体一起复制。在本发明的表达载体中，编码木聚糖分解酶的DNA序列最好是可操作地连接于该DNA转录所需的其它片段上。一般，所述表达载体源于质粒或病毒DNA，或者含有以上两种因子。“可操作地连接”这一用语表示所述片段被设计成能发挥其预定的功能，例如在一个启动子中启动转录，并实现编码木聚糖酶的DNA序列的转录。因此，在本发明的表达载体中，编码木聚糖分解酶的DNA序列应当可操作地连接于合适的启动子和终止序列上。所述启动子可以是能在所选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，而且，可源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。适于在细菌宿主细胞中指导编码本发明木聚糖酶的DNA转录的启动子的例子包括嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦淀粉酶基因，地衣型芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BAN淀粉酶基因、枯草杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽胞杆菌木聚糖酶或木糖苷酶基因的启动子，或入噬菌体PR或PL启动子或大肠杆菌lac、trp或tac启动子。适用于酵母宿主细胞的启动子的例子包括源于酵母糖解基因(Hitzman等，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或醇脱氢酶基因(Young等，GeneticEngineeringofMicroorganismforchemicals(Hollaender等著)，PlenumPress，NewYork，1982)或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4C(Russell等，Nature304(1983)，652-654)的启动子。适用于丝状真菌宿主细胞的启动子的例子有，例如，ADH3启动子(Mcknight等，TheEMBOJ.，4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。其它有用启动子的例子有源于以下基因的启动子编码米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸三糖异构酶或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶的基因。优选TAKA淀粉酶和gluA启动子。本发明的表达载体还可以包括一个使得该载体能够在相关的宿主细胞中表达的DNA序列。该表达载体还可以包括一个选择标记，如一个一基因，其产物可弥补宿主细胞的某种缺陷，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或酿酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)TPI基因(由RussellPR，Gene1985，40，125-130公开)，或能对某种药物，如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤产生抗性的基因。对于丝状真菌来说，选择标记包括amdS、pyrG、ArgB、niaD和sC。为了引导木聚糖分解酶进入宿主细胞的分泌通道，可以在表达载体上设置一个分泌信号序列(又被称作前导序列、前原序列或前序列)。所述分泌信号序列以正确读框与编码木聚糖分解酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码木聚糖分解酶的DNA序列的5’末端。所述分泌信号序列可以是与木聚糖分解酶正常结合的，或是源于一种编码另一种分泌蛋白的基因。在一种优选实施方案中，本发明的表达载体可以包括一个分泌信号序列，其与地衣型芽胞杆菌α-淀粉酶基因的分泌信号编码序列大致相同，如在WO86/05812中所披露的。另外，扩增表达的方法可以用诸如串联扩增技术之类的方式进行，该技术涉及单交换或双交换，或通过多拷贝技术进行，如在US4,959,316或91/09129中披露的技术。另外，所以表达载体可以包括一个对温度敏感的复制起点，如在EP283,075中所披露的。用于分别连接编码木聚糖分解酶的DNA序列、启动子和选择性地连接终止序列和/或分泌信号序列的方法，以及将其插入含有复制所需信息的合适载体上的方法为本领域技术人员所熟知(例如，参见Sambrook等，molecularCloning.ALaboratoryManual，ColdSpringHarber，MY.1989)。宿主细胞在本发明的又一方面，提供了一种含有本发明DNA结构和/或本发明重组表达载体的宿主细胞。本发明的DNA结构可以与相关的宿主同源或异源。如果与宿主细胞同源，即由宿主细胞天然产生，它一般会与另一个启动子序列可操作地连接，或者，如果可能，与另一个分泌信号序列和/或终止序列在其非自然的环境中连接。在本文中，“同源”一词意在包括有关宿主生物所固有的编码木聚糖分解酶的cDNA序列。“异源”意在包括一种不是由宿主细胞天然表达的DNA序列。因此，所述DNA序列可来自其它生物或是一种合成序列。本发明的DNA结构或重组表达载体有待导入其中的本发明的宿主细胞可以是任何能够产生木聚糖分解酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。在培养时能产生本发明木聚糖分解酶的细菌宿主细胞的例子包括革兰氏阳性细菌，如芽胞杆菌属菌株，特别是枯草杆菌、地衣型芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌(Bacilluslentus)、短芽胞杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽胞杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)、环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)、Bacilluslautus、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegatherium)、短小芽胞杆菌、苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)或Bacillusagaradherens菌株，或链霉菌属菌株，特别是变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)菌株，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。细菌的转化可以通过原生质体转化或用感受态细胞以本身已知的方式进行(参见Sambrook等，MolecularCloning.ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，N.Y.1989)。当在诸如大肠杆菌之类的细菌中表达所述木聚糖分解酶时，该木聚糖酶可能存留在该细胞质中，通常为不溶性颗粒(被称为包含体)，或者被一种细菌分泌序列引导至外周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收颗粒并变性，此后，通过稀释变性剂对木聚糖分解酶进行重折叠。在后一种情况下，可以通过裂解细胞从外周质间隙中回收木聚糖分解酶，例如，通过超声或渗透休克以释放出外周质间隙的内含物，并回收木聚糖分解酶。合适的酵母细胞的例子包括酵母菌细胞，特别是酿酒酵母菌株、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)菌株、和葡萄汁酵母菌株，裂殖酵母菌细胞，如粟酒裂殖酵母菌，克鲁维酵母菌属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactis)，汉逊酵母菌属细胞，如多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)，毕亦酵母细胞，如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(参见Gleesen等，J.Gen.Microbiol.132，1986，pp.3459-3465；US4,992,279)和Yarrowia菌细胞，如Yarrowialipolytica细胞。用异源DNA转化酵母细胞的方法，以及由转化的细胞生产异源多肽的方法披露于诸如US4,599,311、US4,931,373、US4,870,008、US5,037,743和US4,845,075的文献中，以上文献均被收作本文的背景资料。转化的细胞是根据由一种选择标记决定的表型进行选择，选择标记通常为药物抗性或在缺乏某种特殊营分，如亮氨酸的条件下生长的能力。用于酵母中的一种优选载体是披露于US4,931,373中的POT1载体。编码本发明木聚糖分解酶的DNA序列可以一个信号序列为前导，并选择性地有一个前导序列，如上文所述。其它真菌细胞的例子有丝状真菌细胞，如曲霉菌，特别是日本曲霉(Aspergillusjaponicus)菌株、米曲霉菌株、构巢曲霉菌株或黑曲霉菌株，链孢霉菌，镰孢菌，特别是尖镰孢(Fusariumoxysporum)或禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)，或木霉菌。真菌细胞可用如下方法转化，该方法包括原生质体生成和原生质体转化，接着是细胞壁再生，该方法本身是已知的。将曲霉菌用于表达蛋白的方法披露于诸如EP272,277和EP230,023之类的文献中。例如，尖镰孢的转化可以按照Malardier等披露的方法(Gene，1989，78，147-156)进行。在EP238023中披露了将曲霉属用作宿主微生物的构思，该专利的内容被收作本文的背景资料。在一种优选实施方案中，宿主细胞是米曲霉菌株。生产单组分制剂的方法再一方面，本发明提供了一种生产本发明木聚糖分解酶的方法，其中，用编码木聚糖分解酶的DNA序列转化过的一种合适的宿主细胞在能够产生所述酶的条件下培养，并从培养物中回收所得到的酶。又一方面，本发明涉及一种生产一种单组分木聚糖酶制剂的方法，其中，用编码所述酶的DNA序列转化过的一种合适的宿主细胞在能够产生所述木聚糖酶组分的条件下培养，并从培养物中回收该木聚糖酶组分。在一种优选实施方案中，编码所述酶的DNA序列是一种按上述方法获得的DNA结构。在另一种优选实施方案中，所述DNA结构与一个合适的表达信号在上述表达载体里结合。在另一种优选实施方案中，宿主细胞是上述细胞中的一种。用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是适合于所述宿主细胞生长的任何常规培养基。所表达的木聚糖分解酶可以方便地分泌到培养基中，并可通过纯化方法从培养基中回收。众所周知的纯化方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，用诸如硫酸铵之类的盐沉淀培养基里的蛋白类组分，以及诸如离子交换层析、亲和层析之类的层析方法。实施例将结合以下实施例对本发明作进一步说明，这些实施例与权利要求不同，其意图不在于限定本发明的范围。材料和方法供体生物从疏绵状高温霉DSM4109中分离mRNA，所述微生物生长于含有木聚糖的发酵培养基中，在培养期间进行振动，以保证通气充分。生长3-5天后收获菌丝体，迅速冰冻于液氮中并储存在-80℃下。酵母菌株下面用到的酿酒酵母菌株为JG169(MATα；ura3-52；Leu2-3，112；his3-D200；pep4-113；prc1HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。质粒将市售酵母质粒pYES2.0(invitrogen)用于表达。曲霉属表达载体pHD414是质粒p775的衍生物，披露于EP238023中。在WO93/11249中对pHD414有进一步描述。提取全RNA全RNA的提取是用硫氰酸胍进行的，随后超速离心通过5.7MCsCl垫层，并通过oligo(dT)-纤维素亲和层析分离poly(A)+RNA，所用方法披露于WO93/11249中。cDNA合成与修饰通过RNaseH方法(GublerU，HoffmanBJ，Gene1983，25，263-269；Sambrook等，MolecularcloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLab.，ColdSpringHarbor，NY，1989)利用发夹修饰方法由5μgpoly(A)+RNA合成双链cDNA。该方法进一步披露于WO93/11249中。在用绿豆核酸酶处理过以后，用T4DNA聚合酶(Invitrogen)将所述dscDNA补成平端，并按照生产商的说明将该cDNA连接于非回文型BstXI衔接子(1μg/μl，Invitrogen)上。cDNA文库的构建离心回收衔接后的dscDNA，用70％EtOH洗涤，并重新悬浮于25mlH2O中。在进行大规模文库连接之前，在10μl连接缓冲液(同上)中进行4次试验连接，每次连接用缓冲液中含有1μldscDNA(反应试管#1-#3)，2单位T4连接酶(Invitrogen)和50ng(试管#1)，100ng(试管#2)和200ng(试管#3和#4)BstXI切过的酵母表达载体(或为pYES2.0载体，Invitrogen，或为yHD13)。采用合适条件在40μl连接缓冲液中进行大规模连接。将1μl样品转化到电感受态大肠杆菌1061细胞中，对转化细胞进行滴定，并将文库置板于LB+氨苄青霉素的培养皿上，菌落形成单位为5000-7000c.f.u./皿。向每个培养皿中加3ml培养基。刮取细菌，加入1ml甘油，并作为原料库于-80℃下保存。其余2ml用于DNA分离。有关该方法的进一步细节，参见WO94/14952。构建酵母文库为了保证所有细菌克隆是在酵母中检验的，将酵母转化体数为细菌克隆数的5倍定为原始材料库的极限。将自单个库中提取的1μl纯化质粒DNA(140ng/μl)样品通过电击法(200Ω，1.5KV，25μF)转移到40μl感受态酿酒酵母JG169细胞中在500mlYPD中OD600＝1.5，用冷DIW洗2次，用冷的1M山梨醇洗1次，重新悬浮于0.5ml1M山梨醇(BeckerDM，GuaranteL，MethodsEnzymol.1991，194，182-187)中)。在加入1ml1M冷山梨醇后，将80μl的样品置板于SC+葡萄糖-尿嘧啶上，使菌落形成单位为250-400c.fu/皿，并在30℃下培养3-5天。鉴定阳性菌落在生长3-5天以后，将琼脂板复制铺板于SC-尿嘧啶板上，其含有0.2％天青蛋白交联的桦木聚糖(AZCLTM桦木聚糖，MegazymeTM，Australia)，和2％半乳糖，然后在30℃下培养2-4天以检验木聚糖分解活性。培养以后，将周围有蓝色晕圈的菌落确定为木聚糖分解酶阳性菌落。将来自酶阳性菌落的细胞展开，以便在琼脂上进行单菌落分离，选择能产生酶的单菌落分别进行木聚糖分解酶产生菌落的鉴定。阳性克隆的鉴定以单菌落形式获得阳性克隆。从用两个阳性酵母克隆制备的细胞培养物中分离质粒DNA。将质粒DNA导入(转化)大肠杆菌中，分离，并对各cDNA克隆的5’-末端测序进行个别鉴定，测序采用链终止法(Sanger等，Proc.Natl，Acad.Sci.U.S.A.1977，74，5463-5467)和SequenaseTMSystem(UnitedStatesBiochemical)。分离用于在曲霉属中表达的cDNA基因将1个或几个木聚糖分解酶产生酵母菌落接种到盛于50ml玻璃试管的20mlYNB-1培养液中。在30℃下振动该试管2天。3000rpm离心10分钟收集细胞。按WO94/14952所述分离的DNA被溶解在50μl水中。按WO94/14952中所述方法用DNA样品转化大肠杆菌。用标准方法从大肠杆菌中分离质粒DNA，并用限制酶分析法进行分析。用合适的限制酶切下cDNA插入片段，并连接到曲霉属表达载体上。转化米曲霉或黑曲霉一般方法用米曲霉或黑曲霉孢子接种100mlYPD(Sherman等，MethodsinYeastGenetics，ColdSpringHarborLaboratory，1981)，并在37℃下摇动培养约2天。过滤收集菌丝体，并用200ml0.6MMgSO4洗涤。将菌丝体悬浮于15ml1.2MMgSO4和10mMNaH2PO4，pH5.8的溶液中。在冰上冷却悬浮液，并加入1ml含有120mgNovozymTM234，批号1687的缓冲液。5分钟后加入1ml12mg/mlBSA(Sigma，typeH25)，并在37℃下培养1.5-2.5小时，同时伴以轻微振动，直至在显微镜下检查样品时可见到大量原生质体。通过miracloth过滤悬浮液，将滤液转移到消毒试管中，并在其上堆叠5ml0.6M山梨醇，100mMTris-HCl，pH7.0。在100g下离心15分钟，从MgSO4垫层上部收集原生质体。将2倍体积的STC(1.2M山梨醇、10mMTris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2)加入该原生质体悬浮液中，在1000g下离心该混合物5分钟。将原生质体沉淀重新悬浮于3mlSTC中并进行再沉淀。重复以上过程。最后将原生质体重新悬浮在0.2-1mlSTC中。将100μl原生质体悬浮液与5-25μg合适的DNA在10μlSTC中混合。将原生质体与p3SR2(一种带有构巢曲霉amdS基因的质粒)。该混合物在室温下放置25分钟。加入0.2ml60％PEG4000(BDH29576)、10mMCaCl2和10mMTris-Hcl，pH7.5，并小心混合(2次)，最后加入0.85ml相同的溶液，并小心混合。将混合物在室温下放置25分钟，2500g离心15分钟，将沉淀重新悬浮于2ml1.2M山梨醇中。再经过一次沉淀之后，将原生质体涂布在适当的培养皿上。将原生质体涂布在含有1.0M蔗糖，pH7.0，10mM乙酰胺作为氯源和20mMCsCl抑制背景生长的极限培养皿(Cove，Biochem.Biophys.Acta1966，113，51-56)上。在37℃下培养4-7天后，挑取孢子，并展布成单菌落。重复以上过程，再次分离单菌落的孢子，然后作为确定的转化体进行保存。检验米曲霉转化体将各种转化体接种到10mlYPM(见下文)中，并进行繁殖。在30℃下培养2-5天，然后除去上清液。将10μl上清液加至在含有0.2％AZCLTM桦木聚糖(MegazymeTM，Australia)的琼脂皿上打出的直径为4mm的孔中，以鉴定木聚糖分解活性。用蓝色晕圈确定木聚糖分解活性。杂交条件可以按下述方法确定寡核苷酸探针与本发明“类似的”DNA序列杂交的合适条件。用于杂交的合适寡核苷酸探针可以基于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或其任何亚序列或基于序列2所示的推定氨基酸序列进行制备。一种合适探针的例子是相当于序列1所示木聚糖编码部分的DNA序列，即序列1中31位至705位的核苷酸。在5×SSC中对待杂交的含有DNA片段的滤膜进行预浸，并在50℃左右预杂交1小时，预杂交溶液中含有5×SSC、5×Denhardt’s溶液，50mM磷酸钠，pH6.8，和50μg变性的超声波处理的小牛胸腺DNA。在45℃左右，在补充了50μCi32-P-dCTP标记的探针的相同溶液中杂交18小时，在2×SSC、0.2％SDS的溶液中洗涤该制品3次、30分钟、温度以不超过55℃为宜，尤其是不超过60℃、不超过65℃、不超过70℃、不超过75℃，最好不超过80℃。在上述条件下能与所述寡核苷酸探针杂交的分子可以用X光片进行检测。免疫交叉反应性可以用纯化的木聚糖分解酶制备用于测定免疫交叉反应性的抗体。更具体地讲，可以按照Axelsen等的方法(AManualofQuantitativeImmunoelectrophoresis，BlackwellScientificPublications，1973，特别是第23章)或Johnson和Thorpe的方法(ImmunochemistryinPractice，BlackwellScientificPublications，1982，特别是pp.27-31)通过免疫兔(或其它啮齿类动物)制备抗本发明酶的抗血清。可以从抗血清中获得纯化的免疫球蛋白，例如，通过盐沉淀((NH4)2SO4)，接着进行透析和离子交换层析，例如，在DEAE-Sephadex上进行层析。可以通过Outcherlong双扩散分析(OuchterlonyO；HandbookofExperimentalImmunology(D.M.Weir著)，BlackwellScientificpublications，1967，PP.655-706；或Roittl；EssentialImmunology，BlackwellScientificPublications，1984，Pp.145-147)、交叉免疫电泳(Axelsen等，同上，第3、4章)或火箭免疫电泳(Axelsen等，同上，第2章)进行蛋白的免疫化学鉴定。培养基YPM培养基10g酵母提取物，20g胨，加水至810ml。对90ml麦芽糖糊精进行高压灭菌和灭菌过滤，然后加入上述溶液中。YPD培养基10g酵母提取物，20g胨，加水至810ml。对90ml20％葡萄糖进行高压灭菌和灭菌过滤，然后加入上述溶液中。10X基础盐培养基66.8g酵母氮碱，100g琥珀酸、60gNaOH，加水1000ml，灭菌过滤。SC-URA90ml10×基础盐，22.5ml20％水解酷蛋白氨基酸，9ml1％色氨酸，加水806ml，高压灭菌，加入3.6ml5％苏氨酸和90ml20％葡萄糖或20％半乳糖。SC-H液7.5g/l无氨基酸的酵母氮碱，11.3g/l琥珀酸，6.8g/lNaOH，5.6g/l无维生素的水解酪蛋白氨基酸，0.1g/l色氨酸。在121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌以后向每100ml培养基中加入10ml30％半乳糖溶液，5ml30％葡萄糖溶液和0.4ml5％苏氨酸溶液。SC-H琼脂7.5g/l无氨基酸的酵母氮碱，11.3g/l琥珀酸，6.8g/lNaOH，5.6g/l无维生素的水解酪蛋白氨基酸，0.1g/l色氨酸，和20g/l琼脂(BactoTM)。在121℃下高压灭菌20分钟。灭菌以后向每450ml琼脂中加入55ml22％半乳糖溶液和1.8ml5％苏氨酸溶液。YNB-1琼脂3.3g/lKH2PO4，16.7g/l琼脂，调pH至7。在121℃下高压灭菌20分钟。高压灭菌以后向每450ml琼脂中加入25ml13.6％的无氨基酸酵母氨碱，25ml40％葡萄糖溶液，1.5ml1％L-亮氨酸溶液和1.5ml1％组氨酸溶液。YNB-1液配方同YNB-1琼脂，只是没有琼脂。木聚糖分解活性木聚糖分解活性可以FXU-单位表示，是在pH6.0下以remazol-木聚糖(4-O-甲基-D-葡糖醛-D-木聚糖，用RemazolBrilliantBlueR，Fluka染色)为底物测定的。将木聚糖酶样品与remazol-木聚糖底物一起培养。用乙醇沉淀非降解染色底物的背景。上清液中残余蓝色(在585mm进行分光光度法测定)与木聚糖酶活性成比例，然后与酶标准进行比较测定木聚糖酶单位，测定是在标准反应条件下进行，即50.0℃，pH6.0，30分钟反应时间。一份编号为AF293.6/1的文件对该分析方法有更详细的说明，可以向NovoNordiskA/S，Denmark索取该文件，该文件被收作本文的背景资料。例1基因分离构建一个疏绵状高温霉文库，该文库由在150个库中的大约1.5×106个单一克隆组成。从该文库的20个单一克隆中分离DNA，并进行cDNA插入分析。发现插入的频率＞90％，平均插入大小约为1400bp。将得自上述一些库的DNA转化到酵母中，由每个库获得50-100块含有200-500个酵母菌落的培养皿。生长3-5天，然后将所述琼脂板复制置板到几组琼脂板上。然后在30℃下将一组合有0.1％AZCLTM木聚糖(MegazymeTM，Australia)的板培养3-5天，以检测木聚糖酶的活性。将由蓝色晕圈环绕的菌落确认为阳性菌落。用含有0.1％AZCLTM木聚糖和1％琼脂糖的由具有合适pH的缓冲液制成的木聚糖叠层凝胶叠层之前将一组板在30℃下培养3-5天。在30℃下培养1-2天后即可将由蓝色晕圈环绕的菌落确定为阳性菌落。将来自酶阳性菌落的细胞涂布在琼脂上进行单菌落分离，选择能产生酶的单菌落进行木聚糖酶产生菌落鉴定。阳性克隆的鉴定以单菌落形式获得阳性克隆。用生物素酰化的多接头引物直接由酵母菌落扩增cDNA插入片段，用磁珠(DynabeadTMM-280，Dynal)系统进行纯化并用链终止法(SangerF，NicklenS&amp;CoulsonAR；Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1977，74，5463-5467)和SequenaseTMSystem(UnitedStatesBiochemical)对各个cDNA克隆的5’-末端测序而分别进行鉴定。DNA序列如序列1所示，它与序列2所示的氨基酸序列相应。酵母DNA的分离为了避免在待克隆的基因上出现PCR失误，用标准方法从酵母质粒中分离cDNA，例如，用WO93/11249的例1中所披露的方法，该文献的内容被收作本文的背景资料。将酵母DNA溶于50μl水中，使终浓度大约为100μl/ml。用标准方法将所述DNA转化到大肠杆菌中。从每次转化中分离2个大肠杆菌菌落，并用以能裂解DNA插入片段的限制酶HindIII和XbaI进行分析。将来自上述克隆之一的DNA再次转化到酵母菌株JG169中。对几个阳性克隆的DNA序列进行部分测定。本发明木聚糖酶的DNA序列如序列1所示，该序列相应于序列2所示的氨基酸序列。例2在曲霉属中表达为了在曲霉属中表达该基因，通过用HindIII/Xbal或其它合适的限制酶消化从上述克隆之一中分离cDNA，在凝胶上进行大小分级和纯化，然后连接到pHD414上，得到质粒pA2XITI。在大肠杆菌中扩增以后，将质粒转化到米曲霉菌株中，转化按照在上文的材料和方法部分中所披露的一般方法进行。检验米曲霉转化体将各转化体接种到10mlYPM培养基中。在30℃和250rpm的转速下培养3-5天，然后除去上清液。将10μl上清液加入在琼脂板上打出的直径为4mm的孔中，以测定木聚糖分解活性，在40℃下培养过夜，琼脂板中含有0.2％AZCLTM木聚糖(MegazymeTM，Australia)，用具有合适pH的缓冲液配制而成。按上述方法鉴定木聚糖酶活性。某些转化体的晕圈明显大于米曲霉背景，这证实了木聚糖酶在米曲霉中能有效表达。选择8个具有最大木聚糖酶活性的转化体，接种并维持在YPG-琼脂上。将所选择的8个转化体的每一个从YPG-琼脂斜面接种到装有FG-4和MDU-2培养基的500ml摇瓶中。发酵3-5天，充分振动以保证良好的通气性，然后2000g离心培养液10分钟，并分析上清液。将体积为15μl的每种上清液加入在0.1％AZCLTM木聚糖叠层凝胶(在直径13cm的培养皿中盛有25ml)上打出的直径为4mm的孔中。根据在培养中蓝色晕圈的形成鉴定木聚糖酶活性。然后，在一种培养基中对木聚糖酶进行发酵，培养基中含有作为碳源的麦芽糖糊精、作为氮源的尿素和酵母提取物。发酵是这样进行的将米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物接种到含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中。在pH5.0和34℃下培养24小时，然后开始连续补充额外的碳源和氮源。保持碳源为限制因子并确保有过量的氧气。继续培养4天，然后通过离心、超滤、澄清过滤和细菌过滤回收所述酶。例3纯化实施例对来自例2所述表达重组酶的米曲霉发酵的培养上清液进行离心，并通过0.2μm的滤膜过滤，以除去菌丝体。在配有3kDa膜的FiltronTMUltracette或AmiconTM超滤装置上对100ml过滤的上清液进行超滤，得到10倍浓缩液。在同一装置上所进行的连续两轮超滤中用20mMTRIS，pH8.0将浓缩物稀释100倍。以2ml/分的速度将上述超滤样品加注到一个PharmaciaXK26/20FastFlowQSepharoseTM阴离子交换柱上，该交换柱在20mMTRIS，pH8.0中平衡。上样以后，用2倍柱体积的25mMTRIS，pH8.0洗柱，并用在25mMTRIS，pH8.0中配制的从0到0.5MNaCl的线性增加的NaCl梯度洗脱结合蛋白。收集各级分，并按上述方法测定所述级分中的木聚糖酶活性。合并含有木聚糖酶的级分，并超滤浓缩于10mM柠檬酸钠，pH4.0中。以1.5ml/分的速度将该材料加注到一个XK16/20FastFlowSSepharoseTM柱上。用0-0.4MNaCl的线性梯度洗脱所述酶，并合并含有木聚糖酶的级分，浓缩并用于鉴定和下述其它实验。例4酶鉴定对按照例3方法得到的木聚糖酶进行以下的酶鉴定。SDS-PAGE电泳SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳)在一台Mini-Leak4电泳装置(Kem-En-Tec.，Copenhagen)上进行，该方法为Laemmli方法(LaemmliUK；Nature1970，227，680-685；Christgau等，1991，J.Biol.Chem.1991，266p.21157-212664)的改进形式。测得其分子量(MW)大约为26kDa。等电点聚焦等电点聚焦是在一台MultiphorTM电泳装置中，在AmpholineTMPAG板上，pH3.5-9.5(Pharmacia，Sweden)按照生产商的推荐进行的。电泳以后，按照本领域公知的方法进行考马斯亮蓝染色。测得等电点(PI)大约为4.5。pH和温度最佳值根据从AZCLTM桦木聚糖(Megazyme，Australia)中释放的蓝色测定酶促活性。将0.5ml0.4％AZCLTM底物与0.5ml合适pH的0.1M柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液混合，并加入10μl适当稀释的酶溶液。在30℃下，在EppendorphThermomixer中培养15分钟，然后在95℃下加热20分钟灭活。酶的培养做3个重复。作一个空白对照，其中加过酶但立即灭活。离心以后在620mm波长下在微量滴定板上测光吸收，并扣除空白对照的吸收值。将0.1M的不同pH的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液用于测定最佳pH值。将0.1M，pH5.5的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液在不同温度下培养15分钟，以便测定最佳温度值。结果如图1-2所示。图1表示在30℃下，在pH2.5-9范围内测得的相对木聚糖分解活性(％)。从图中可以看出，该酶的最佳pH值范围为4.5-7.5，特别是在5.0-6.5的范围内，pH6左右。图2表示在pH5.5和30-80℃的温度范围内测得的相对木聚糖分解活性(％)。从图中可以看出，温度最佳值在50-70℃范围内，60℃左右。例5热稳定性比较在该实施例中，对按照例1-3所述方法获得的单组分木聚糖酶制剂的热稳定性和天然疏绵状高温霉的木聚糖酶制剂的热稳定性进行了比较。天然疏绵状高温霉木聚糖酶按如下方法制备。将疏绵状高温霉菌株DSM4109在200lYPG培养基中接种24小时，该培养基的配方如下(g/l)酵母提取物，50％10葡萄糖5KH2PO43Na2HPO4，2H2O2FeSO40.25MgSO4，7H2O2Pluronic0.7调pH至6.0接种以后，将接种物加至2000l下列培养基中(g/l)，并再发酵3天酪蛋白酸钠10大豆粉20Na2HPO4，2H2O3木聚糖3木糖500调pH至7.5离心除去细胞，并通过超滤(用10,000MW的截断膜)浓缩上清液，通过冷冻干燥将UF浓缩物转化成粗制粉状物。用pH6.0的100mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液稀释上述制剂，以便在用于进行下述酶促活性分析时该酶的活性在线性分析范围内。稀释的样品等分成2ml试样，分别置于60、65、70和75℃的水浴中。对照保持在冰水中。培养60分钟后将样品取出并放入冰水中。将获自山毛榉的remazol-木聚糖作为底物(4-O-甲基-D-葡糖醛-D-木聚糖，用RemazolBrilliantBlueR，Fluka染色)。用pH6.0的l00mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液溶解上述底物，制成0.5％(W/V)的溶液。为了测定残余酶活性，将0.9ml底物加入4支试管(2个主值，2个空白)中，并在50℃的水浴中预热5分钟。t＝0时，将0.1ml的酶样品加至所有组成主值的试管中并混合。60分钟后，加入5ml乙醇试剂(150ml99.9％的乙醇与1ml2NHCl的混合物)终止培养，接着在Whirlimixer上摇10秒钟。先向所有组成空白的试管中加入5ml乙醇试剂，接着再加入0.1ml酶样品，并在Whirlimixer上摇10秒钟。将所有试管在环境温度下放置约15分钟，然后以4,000rpm的速度离心10分钟。最后，在585nm光波长下测光密度，将两次测定的结果加以平均，并扣除空白值。作为培养温度和培养时间的函数测定的相对残余酶活性，以对照值的百分比形式计算(对照值被定为“100％”)。结果如图3所示。在图中，对比给出了本发明单组分木聚糖酶制剂的残余活性(空白柱)和天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂的残余活性(影线柱)。给出了在pH6.0下，在60、65、70和75℃温度下分别培养30和60分钟以后的残余活性。从图中可以看出，本发明的木聚糖酶组分在pH6.0和60℃下培养60分钟以后的残余酶活性高于96％，尤其是高于97％，大致为100％。本发明的木聚糖酶组分在pH6.0和65℃下培养60分钟后的残余酶活性高于83％，特别是高于85％，尤其是高于90％，大致为100％。本发明的木聚糖酶组分在pH6.0和70℃下培养60分钟以后的残余酶活性高于20％，高于30％较好，高于40％更好，高于50％还要好，约为63％。本发明的木聚糖酶组分在pH6.0和75℃下培养60分钟后的残余酶活性高于9％，特别是高于10％，高于20％更好，高于30％还要好，约为48％。从图中还可以看出，与天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂相比，本发明单组分木聚糖酶制剂的热稳定性明显改善。本发明单组分木聚糖酶制剂在热稳定性方面出人预料的改善，除了使其可以作为优良的饲料增强酶之外，还特别适于加入动物饲料添加剂中。当加入动物饲料添加剂中时，该酶的热稳定性在防止微生物感染饲料方面起着重要作用。例6降低体外粘度业已证实前肠消化物粘度是影响小麦和大麦基烤鸡饲料可消化性的主要营养制约因素。业已发现消化物粘度降低结果与鸡饲料转化效率之间的密切相关的关系(例如，参见GrahamH，BedfordM和ChoctM；Feedstuffs，1993，65(5)14-15)。在该实验中，分别检验了用(i)按例1-3方法获得的重组生产的单组分疏绵状高温霉木聚糖酶制剂，(ii)按例5方法培养获得的天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂和(iii)通过培养Humicolainsolens获得的市售多组分酶制剂(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一种产品，Denmark)获得的小麦粘度的降低。在t＝0时，将12g细度为1mm的磨碎的干小麦(“StatensHusdyrbrugsforsΦg”，Foulum，Denmark)与38ml萃取缓冲液混合，该缓冲液为pH1.5的0.5MHCl-KCl，保持在40℃并伴以持续搅拌。在培养期间，用锡泊覆盖样品。t＝89分钟时，用1MNaOH调pH至6.0(±0.15)。当t＝90分钟时，加入总体积为40ml的酶溶液。对上述(i)-(iii)的酶制剂进行稀释，使酶的终浓度为0.16-5.19FXU/g小麦。所有的实验都作两次，即，未加入任何酶的溶液总是包括在两次实验内。培养30分钟之后，取样进行粘度测定。采用一台BrookfieldLVDV-III粘度计，其装配有一个小型样品衔接头和型号为SC4-31的锭子，在250rpm时相当于剪切速度为85S-1。在每次测定时，将约13ml悬浮液迅速注入所述小型样品衔接头中，该接头被置于水套管中，由恒温水将其加热至40℃。进行3次独立的cP读数，每次15秒，采用平均值。在任何情况下加酶所获得的结果资料都是以相对粘度形式表示，即相对于在对照样品中测得的粘度，将其定为“1”。在图4中，给出了(ii)天然疏绵状高温霉木聚糖酶，剂量为0.16、0.32、0.65、1.29和2.58FXU/g小麦的小麦粘度降低效率(·)和(iii)通过培养Humicolainsolens获得的多组分酶制剂，剂量为0.32、0.65、1.29、2.58和5.19FXU/g小麦的小麦粘度降低效率(×)的对比。以图中可以看出，与通过培养Humicolainsolens获得的多组分酶制剂(iii)相比，天然疏绵状高温霉木聚糖酶(ii)能明显降低小麦悬浮液的粘度，以FXU为基础计算。另外，在图5中，对(i)重组生产的单组分疏绵状高温霉木聚糖酶(I)和(ii)天然疏绵状高温霉木糖酶(II)之间的小麦粘度降低效率进行了比较。结果是基于两种类似的剂量，0.65和2.58FXU/g小麦。从图中可以看出，对小麦悬浮液粘度的影响十分相似。纵观该实施例，可以明显看出，与现有饲料添加剂相比，源于疏绵状高温霉的木聚糖酶具有卓越的降低小麦悬浮液粘度的能力，因此，具有作为饲料增强酶的巨大潜力。例7疏绵状高温霉木聚糖酶作为饲料增强酶在该实施例中，将疏绵状高温霉单组分木聚糖酶制剂加入动物饲料中并与常规消化性增强酶制剂进行比较。按例1-3的方法获得单组分木聚糖酶制剂。参比制剂为现有的饲料添加剂，即一种通过培养Humicolainsolens而获得的多组分酶制剂(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一种产品，Denmark)。用有和没有酶的实验饲料饲养适于烤制的小鸡3周。饲料的配方如下列表1所示。将动物分成5个大组，并进行5种不同的处理。每一大组又分成由30只小鸡(每种性别各15只)组成的8个小组(笼)。分别对每小组(笼)称重。5种不同的处理中包括无酶的对照处理和如下的加酶处理参比制剂为400和800FXU/kg饲料(Ref)，本发明的单组分木聚糖酶制剂为200和400FXU/kg饲料(Inv.)。表1饲料配方</tables>对初生的小鸡开始进行处理。处理3周以后测定重量增加和饲料的消耗，并计算饲料转化率(FCR)，参见下面的表2(其中，给出了3周龄小鸡的重量和饲料的摄入量)。从表2中可以看出，在接受200FXU/kg饲料的本发明酶制剂(Inv.)的组中FCR降低，其参比对象为对照组和接受400FXU参比制剂(Ref.)的组。不过，使用200FXU的本发明酶制剂后计算出的FCR与使用800FXU参比制剂后计算出的FCR处于同一水平，这表明，与参比制剂相比，本发明的酶制剂在其1/4FXU的剂量水平上有相同的效果。因此，本发明的酶被认为在改善饲料的可消化性方面比参比制剂的效果好。尽管本发明的制剂是一种单组分制剂，但它与现有饲料添加剂相比具有卓越的提高可消化性的能力，它能产生多种酶组分的作用。表20-3周的产量参数</tables>例8提高鸡饲料中小麦的可代谢能量该实施例对本发明的两种动物饲料添加剂和现有饲料添加剂对小麦的表现可代谢能(AME)值进行了比较。本发明的两种动物饲料添加剂为(A)按照例1-3中所述的重组DNA技术所获得的疏绵状高温霉单组分木聚糖酶制剂，和(B)通过例5方法获得的天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂。现有的饲料添加剂为通过培养Humicolainsolens获得的一种多组分酶制剂(C)(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一种产品，Denmark)。使用从市售孵化器中输出的初生雄性Ross烤鸡。第1-16天用一种市售幼雏饲料饲养。在第16天时单独称重。将体重太大或太小的小鸡剔除，并将其余的安置到成组的笼中。第16-23天在笼中饲养。从第24-28天进行平衡试验，试验按照体内测定可代谢能AME的EuropeanReferenceMethod进行(Bourdillon等，Br.Pouly.Sci.1990，31，557-565)。该试验包括9种处理的5个重复，每个重复4只烤鸡。基础饲料中含有56％高梁、32.5％大豆粉、6％动物脂肪、1％大豆油和5％矿物质、维生素、微量元素和氨基酸。在实验饲料中，1/2基础饲料被小麦所取代。用醪液含量为90％的饲料饲养这些鸡，让鸡任意摄食。每日定量收集排泄物。分析饲料样品和冻干的排泄物中的脂肪、总能量(GE)和氮。由其相应的排泄物/饲料比及其相应的GE含量计算饲料的AME含量。用保留的34.36kJ/gN的能量当量将N-保留量校正为0(AMEn)。从饲料和冻干的排泄物中提取脂肪测定脂肪的可消化性，考虑了排泄物/饲料比。通过对用LSD-多范围试验确认为显著差异的方差进行单因子分析，分析所述结果，采用Statgraphics5版。结果示于下面的表3和图6-7中。图6表示作为木聚糖酶加入量(FXU/kg饲料)函数的小麦AMEn值(MJ/kg)(A)疏绵状高温霉单组分木聚糖酶制剂；(B)天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂；(C)参比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一种产品，Denmark；一种通过培养Humicolainsolens获得的多组分酶制剂)。图7表示实验饲料中的脂肪消化率(％)，其作为木聚糖酶添加量(FXU/kg饲料)的函数；(A)疏绵状高温霉单组分木聚糖酶制剂；(B)天然疏绵状高温霉木聚糖酶制剂；(C)参比物(Bio-FeedPlusCT，NovoNordiskA/S的一种制品，Denmark；一种通过培养Hunicolainsolens获得的多组分酶制剂)。用200FXU/kg饲料的(A)或(B)补充基础饲料，会导致AMEn平均值以及脂肪消化率的较小的增加和无明显增加(见表3)。结果，在计算小麦的AMEn值时，无须对木聚糖酶对基础成分的活性进行校正。在实验饲料中，(A)和(B)的剂量为100和200FXU/kg饲料，而(C)的剂量为400FXU/kg饲料。从表3中可以看出，与仅用实验饲料相比，两种剂量的本发明动物饲料添加剂都能明显提高AMEn。加入本发明的酶后，可将小麦的AMEn值提高4.9-8.6％。参比添加剂(C)能将小麦的AMEn提高4.9％。通过比较本发明的动物饲料添加剂和现有添加剂可以清楚地看出，以FXU基重为剂量计，本发明动物饲料添加剂的表现明显优于参比添加剂的。200FXU/kg(B)明显好于400FXU/kg(C)。实验饲料的脂肪消化率与AMEn值的变化形式类似。表3序列表序列1资料(i)序列特征(A)长度983bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(vi)起源(A)生物疏绵状高温霉(B)菌株DSM4109(ix)特征(A)名称/键词CDS(B)位置31..705(xi)序列描述序列1TCGGCCCGACGTCTTGCAATCCTTGCAGTGATGGTCGGCTTTACCCCCGTTGCC54MetValGlyPheThrProValAla15CTTGCGGCCTTAGCCGCGACTGGGGCCCTGGCCTTCCCGGCAGGGAAT102LeuAlaAlaLeuAlaAlaThrGlyAlaLeuAlaPheProAlaGlyAsn101520GCCACGGAGCTCGAAAAGCGACAGACAACCCCCAACTCGGAGGGCTGG150AlaThrGluLeuGluLysArgGlnThrThrProAsnSerGluGlyTrp25303540CACGATGGTTATTACTATTCCTGGTGGAGTGACGGTGGAGCGCAGGCC198HisAspGlyTyrTyrTyrSerTrpTrpSerAspGlyGlyAlaGlnAla455055ACGTACACCAACCTGGAAGGCGGCACCTACGAGATCAGCTGGGGAGAT246ThrTyrThrAsnLeuGluGlyGlyThrTyrGluIleSerTrpGlyAsp606570GGCGGTAACCTCGTCGGTGGAAAGGGCTGGAACCCCGGCCTGAACGCA294GlyGlyAsnLeuValGlyGlyLysGlyTrpAsnProGlyLeuAsnAla758085AGAGCCATCCACTTTGAGGGTGTTTACCAGCCAAACGGCAACAGCTAC342ArgAlaIleHisPheGluGlyValTyrGlnProAsnGlyAsnSerTyr9095100CTTGCGGTCTACGGTTGGACCCGCAACCCGCTGGTCGAGTATTACATC390LeuAlaValTyrGlyTrpThrArgAsnProLeuValGluTyrTyrIle105110115120GTCGAGAACTTTGGCACCTATGATCCTTCCTCCGGTGCTACCGATCTA438ValGluAsnPheGlyThrTyrAspProSerSerGlyAlaThrAspLeu125130135GGAACTGTCGAGTGCGACGGTAGCATCTATCGACTCGGCAAGACCACT486GlyThrValGluCysAspGlySerIleTyrArgLeuGlyLysThrThr140145150CGCGTCAACGCACCTAGCATCGACGGCACCCAAACCTTCGACCAATAC534ArgValAsnAlaProSerIleAspGlyThrGlnThrPheAspGlnTyr155160165TGGTCGGTCCGCCAGGACAAGCGCACCAGCGGTACCGTCCAGACGGGC582TrpSerValArgGlnAspLysArgThrSerGlyThrValGlnThrGly170175180TGCCACTTCGACGCCTGGGCTCGCGCTGGTTTGAATGTCAACGGTGAC630CysHisPheAspAlaTrpAlaArgAlaGlyLeuAsnValAsnGlyAsp185190195200CACTACTACCAGATCGTTGCAACGGAGGGCTACTTCAGCAGCGGCTAT678HisTyrTyrGlnIleValAlaThrGluGlyTyrPheSerSerGlyTyr205210215GCTCGCATCACCGTTGCTGACGTGGGCTAAGACGTAACCTGGTGGTG725AlaArgIleThrValAlaAspValGly220225ATCTCGCGAGGCAACAGCCAAGAATGTCGTCAGATGTGCCGGTTGAAGGTATTCAATCAG785CATATCTGTCTGCCCTTGCGAGTGATACTTTGGAGGACTGTGGAGAACTTTGTGCGAGCC845TGGCCAGGATCAGTAGTTGCTTTGCGGTGTTTTGCTCCCTATTCTCGTGAAAAAATTGTT905ATTGCTTCGTTGTCTAGTGTACATAGCCGAGCAATTGAGGCCTCACGCTTGGGAAAAAAA965AAAAAAAAAAAAAAAAAA983序列2资料(i)序列特征(A)长度225个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构；线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述序列2MetValGlyPheThrProValAlaLeuAlaAlaLeuAlaAlaThrGly151015AlaLeuAlaPheProAlaGlyAsnAlaThrGluLeuGluLysArgGln202530ThrThrProAsnSerGluGlyTrpHisAspGlyTyrTyrTyrSerTrp354045TrpSerAspGlyGlyAlaGlnAlaThrTyrThrAsnLeuGluGlyGly505560ThrTyrGluIleSerTrpGlyAspGlyGlyAsnLeuValGlyGlyLys65707580GlyTrpAsnProGlyLeuAsnAlaArgAlaIleHisPheGluGlyVal859095TyrGlnProAsnGlyAsnSerTyrLeuAlaValTyrGlyTrpThrArg100105110AsnProLeuValGluTyrTyrIleValGluAsnPheGlyThrTyrAsp115120125ProSerSerGlyAlaThrAspLeuGlyThrValGluCysAspGlySer130135140IleTyrArgLeuGlyLysThrThrArgValAsnAlaProSerIleAsp145150155160GlyThrGlnThrPheAspGlnTyrTrpSerValArgGlnAspLysArg165170175ThrSerGlyThrValGlnThrGlyCysHisPheAspAlaTrpAlaArg180185190AlaGlyLeuAsnValAsnGlyAspHisTyrTyrGlnIleValAlaThr195200205GluGlyTyrPheSerSerGlyTyrAlaArgIleThrValAlaAspVal210215220Gly225INDICATIONSRELATNGTOADEPOSITEDMICROORGANISM(PCTRule13bis)权利要求1.一种动物饲料添加剂，该添加剂含有一种单组分木聚糖酶，该木聚糖酶源于腐质霉属菌株、嗜热子囊菌属菌株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株、丝衣霉属菌株、或拟青霉属菌株。2.如权利要求1的动物饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶源于高温霉属菌株。3.如权利要求2的动物饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株。4.如权利要求3的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株DSM4109或其突变体或突变型。5.如权利要求1-4任一项的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶的免疫化学特性相同于或部分相同于下列纯化木聚糖酶的免疫化学特性，该纯化木聚糖酶或a)源于疏绵状高温霉菌株DSM4109；或b)由序列1所示的DNA序列编码；或c)由可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。6.如权利要求1-5中任一项的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶源于一种带有编码所述木聚糖酶组分的基因的宿主细胞。7.如权利要求1-6中任一项的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶是a)由序列1所示DNA序列编码，或由可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码；或b)由类似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或类似于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的DNA序列编码，该类似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分，或同源于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列；或ii)能与同序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分相同的寡核苷酸探针杂交，或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列杂交；或iii)能编码一种多肽，该多肽与由序列1所示DNA序列编码的多肽或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的同源性至少为70％；或iv)能编码一种多肽，该多肽能与抗纯化木聚糖酶的抗体进行免疫反应，该纯化木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。8.如权利要求1-7中任一项所述的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶的其它特征为在pH6.0和60℃下培养60分钟后的残余酶活性高于96％。9.如权利要求1-7中任一项的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶的其它特征为在pH6.0和65℃下培养60分钟后的残余酶活性高于83％。10.如权利要求1-7中任一项的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶的其它特征为在pH6.0和70℃下培养60分钟后的残余酶活性高于20％。11.如权利要求1-7中任一项的饲料添加剂，其中，所述单组分木聚糖酶的其它特征为在pH6.0和75℃下培养60分钟后的残余酶活性高于10％。12.如权利要求1-11任一项的饲料添加剂，其含有一种或几种其它的饲料增强酶。13.如权利要求12的饲料添加剂，其含有一种或几种其它的饲料增强酶，所述酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、植酸酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和蛋白酶。14.如权利要求1-13中任一项的饲料添加剂，以干组合物形式提供，优选为包衣或未包衣的颗粒，或以稳定化液体组合物形式提供，优选为水基或油基组合物。15.一种单组分木聚糖酶制剂，其中，木聚糖酶组分源于腐质霉属菌株、嗜热子囊菌属菌株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株、丝衣霉属菌株或拟青霉属菌株。16.如权利要求15的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分源于高温霉属菌株。17.如权利要求16的单组合木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分源于疏绵状高温霉菌株。18.如权利要求17的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分源于疏绵状高温霉菌株DSM4109或其突变体或突变型。19.如权利要求15-18中任一项的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分的免疫化学特性相同于或部分相同于一种纯化木聚糖酶的免疫化学特性，所述纯化木聚糖酶或a)源于疏绵状高温霉菌株DSM4109；或b)由序列1所示DNA序列编码；或c)由可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。20.如权利要求15-19中任一项的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分源于一种带有编码该木聚糖酶组分的基因的宿主细胞。21.如权利要求22的单组分酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分是a)由序列1所示DNA序列编码，或由可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码；或b)由类似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或类似于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的DNA序列编码，该类似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分，或同源于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列；或ii)能与和序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分相同的寡核苷酸探针杂交，或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列杂交；或iii)能编码一种多肽，该多肽与由序列1所示DNA序列编码的多肽或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的同源性至少为70％；或iv)能编码一种多肽，该多肽能与抗纯化木聚糖酶的抗体进行免疫反应，该纯化木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。22.如权利要求15-21中任一项的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分在pH6.0和60℃下培养60分钟后的残余酶活性高于96％。23.如权利要求15-21中任一项的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分在pH6.0和65℃下培养60分钟后的残余酶活性高于83％。24.如权利要求15-21中任一项的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分在pH6.0和70℃下培养60分钟后的残余酶活性高于20％。25.如权利要求15-21中任一项的单组分木聚糖酶制剂，其中，所述木聚糖酶组分在pH6.0和75℃下培养60分钟后的残余酶活性高于10％。26.一种DNA结构，含有编码一种木聚糖酶组分的DNA序列，该DNA序列包括a)序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分，或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列；或b)类似于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分或类似于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的DNA序列，该类似DNA序列或i)同源于序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分，或同源于可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列；或ii)能与和序列1所示DNA序列的木聚糖酶编码部分相同的寡核苷酸探针杂交，或与可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒中获得的DNA序列杂交；或iii)能编码一种多肽，该多肽与由序列1所示DNA序列编码的多肽或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列的同源性至少为70％；或iv)能编码一种多肽，该多肽能与抗纯化木聚糖酶的抗体进行免疫反应，该纯化木聚糖酶源于疏绵状高温霉菌株DSM4109或由序列1所示DNA序列或可从酿酒酵母菌株DSM10133中的质粒获得的DNA序列编码。27.如权利要求26的DNA结构，其中，所述编码木聚糖酶组分的DNA序列源于腐质霉属菌株、嗜热子囊菌属菌株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株、丝衣霉属菌株或拟青霉属菌株。28.如权利要求27的DNA结构，其中，所述编码木聚糖酶组分的DNA序列源于高温霉属菌株。29.如权利要求28的DNA结构，其中，所述编码木聚糖酶组分的DNA序列源于疏绵状高温霉菌株。30.如权利要求29的DNA结构，其中，所述DNA序列源于疏绵状高温霉DSM4109或其突变体或突变型的DNA文库或由其产生。31.一种重组表达载体，含有权利要求26-30中任一项的DNA结构。32.一种宿主细胞，含有权利要求26-30中任一项的DNA结构或权利要求31的重组表达载体。33.如权利要求32的宿主细胞，它是一种真核细胞，特别是真菌细胞，优选为酵母细胞或丝状真菌细胞。34.如权利要求32的宿主细胞，该细胞属于曲霉属菌株，特别是黑曲霉或米曲霉菌株。35.一种生产权利要求15-25的单组分木聚糖酶制剂的方法，该方法包括在适于所述木聚糖酶组分产生的条件下培养权利要求32-34中任一项的宿主细胞，然后从培养物中回收所述木聚糖酶组分。全文摘要本发明涉及动物饲料添加剂,设添加剂含有一种单组分木聚糖酶,该木聚糖酶源于腐质霉属菌株、嗜热子囊菌属菌株、毛壳菌属菌株、毛霉属菌株、蓝霉菌属菌株、Malbranchea属菌株、毁丝霉属菌株、梭孢壳属菌株、丝衣霉属菌株或拟青霉属菌株。本发明的其它方面涉及单组分木聚糖酶制剂、DNA结构、重组表达载体、宿主细胞、以及生产单组分木聚糖酶制剂的方法。文档编号C12N15/00GK1169752SQ9619160公开日1998年1月7日申请日期1996年1月26日优先权日1995年1月26日发明者P·K·汉森,P·瓦格尔,A·穆勒特茨,I·H·克纳普申请人:诺沃挪第克公司