专利名称：：巨噬细胞来源的趋化因子和趋化因子类似物的制作方法
技术领域：
：大体来说，本发明是有关趋化因子的，更具体而言是纯化和分离编码一种新的人C-C趋化因子的多核苷酸，纯化和分离由该多核苷酸编码的趋化因子蛋白，以及新的趋化因子蛋白的重组体生产的材料和方法。背景趋化因子，也称作“胞间分泌因子”和“SIS细胞因子”，组成一族小的分泌蛋白(例如、70-100个氨基酸和8-10千道尔顿)，它吸引和活化白细胞，从而辅助免疫系统的激活和调节。“趋化因子”的名字来自趋化性的细胞因子，因这些蛋白能刺激白细胞的趋化性。确实，趋化因子可能构成炎性细胞进入病理组织的主要吸引分子。一般参考巴格欧利尼等，免疫学进展，5597-179(1994)。虽然白细胞有丰富的趋化因子，不同的趋化因子在大量的组织中也表达。同上杂志，表2。以前确认的趋化因子，互相之间一般具有20-70％的氨基酸同一性，含4个高度保守的半胱氨酸残基。根据前二个半胱氨酸的相对位置，趋化因子可进一步分为二个亚族。“C-X-C”或“α”亚族，编码的基因位于人第4号染色体上，前二个半胱氨酸被一个氨基酸隔开。“C-C”或“β”亚族，编码的基因位于人17号染色体上，前二个半胱氨酸是相邻的。X-射线晶体学和NMR对不同的趋化因子研究表明，在每一族中，第一和第三个半胱氨酸形成第一条二硫键，第二和第四个半胱氨酸形成第二条二硫键，强烈地影响蛋白的天然构象。仅在人类中，已描述了每一趋化因子亚族有近十个不同的序列。二类亚族的趋化因子具有20-25个氨基酸的特征性前导序列。C-X-C趋化因子，包括IL-8，GROα/β/γ，血小板碱性蛋白，血小板因子4(PF4)，IP-10和其它种类；当比较任二个氨基酸序列时(除GROα/β/γ成员间，互相有84-88％的同一性外)，享有大约25％-60％的同一性。大多数C-X-C趋化因子(不包括IP-10和血小板因子4)在前二个半胱氨酸残基上游，有一个共同的E-L-R三肽基序(motif)；它们是嗜中性粒细胞的强刺激因子，引起快速的形态变化，趋化性，呼吸爆发和脱粒化。这些效应由七个跨膜域的，视紫红质样的G蛋白偶联受体所介导；对IL-8特异的受体已被赫尔姆斯等，科学，2531278-80(1991)克隆出来，而识别IL-8，GRD和NAP2的相似受体(77％的同一性)已由墨菲和蒂菲尼，科学，2531280-83(1991)克隆。逐步地去除某一C-X-C趋化因子，包括IL-8，的N端氨基酸序列，与活性的显著增加有关。C-C趋化因子包括巨噬细胞炎性蛋白MIP-1α和MIP-1β，单核细胞化学引诱蛋白1，2和3(MCP-1/2/3)，RANTES，I-309和其它种类，互相之间享有25％-70％氨基酸同一性。所有前已确认的C-C趋化因子能活化单核细胞，引起钙流和趋化性。更为选择性的效应是对淋巴细胞，如T淋巴细胞对RANTES有最佳反应。迄今为止，五个具七个跨膜域G蛋白偶联的趋化因子受体已被克隆，包括识别MIP-1α和RANTES的C-C趋化因子受体-1(CCR1)(内特等，细胞，72415-425(1993))，识别MCP-1的CCR2受体(查罗等，美国国家科学院院报，912752-56(1994))；识别eotaxin的CCR3(康帕蒂尔，生物化学杂志，27016491(1995))；识别MIP-1α、RANTES和MCP-1的CCR4(普安等，生物化学杂志，27019495(1995))；和识别MIP-1α、MIP-1β和RANTES的CCR5(萨姆森等，生物化学，353362(1996))。在不同的病理状态下，许多趋化因子，特别是IL-8的作用已有充分的文献记载。一般可参见巴格欧利尼等，同前，表7。如牛皮癣与IL-8的过量产生相关，不同的研究观察到风湿病、骨关节炎和痛风的患者，其发炎的关节滑液有高水平的IL-8。尽管比IL-8的作用了解得少，在病理状态下C-C趋化因子的作用也有记载。例如，类风湿关节炎患者的滑液中，MCP-1的浓度比其它关节炎患者高。单核吞噬细胞的MCP-1依赖性内流是特发性肺纤维化形成的重要事件。C-C趋化因子在进入动脉粥样硬化区的单核细胞募集中的作用，目前已引起广泛的兴趣，在巨噬细胞丰富的动脉壁区而不是一般的动脉组织中，已检测到MCP-1增强性表达。MCP-1在恶性细胞中的表达显示抑制这些细胞体内成瘤的能力。(见美国专利号5,179,078，在此引入作为参考)。因而有必要对另外的C-C趋化因子予以确认，描述其特征，进一步说明这个分子重要家族在病理状态中的作用，和应用衍生于趋化因子的产物，对这些病理状态进行改进治疗。已表明C-C亚族的趋化因子可用于医学成像，如对感染，炎症位点和其它具有C-C趋化因子受体分子的位点进行成像。如见昆克尔等，美国专利号5,413,778，在此引入作为参考。此种方法涉及的步骤是，用人工识别技术(如见美国专利号4,965,392和5,037,630，在此引入作为参考)，把标记剂(如放射性同位素)化学附着在C-C趋化因子上，让受试者用药学可接受的载体服用标记的趋化因子，使标记的趋化因子在靶位积累，对标记的趋化因子在体内靶位成像。本领域需要有另外新的C-C趋化因子，以增加医学成像工具的有效贮存。也已表明C-C趋化因子RANTES、MIP-α和MIP-1β是人T细胞对人免疫缺陷病毒(HIV)的抑制效应的主要介导者，HIV导致引起人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。这些趋化因子显示抑制HIV特异株感染培养T细胞系，具有剂量依赖性[科克希等，科学，2701811(1995)]。不过，并不是所有受试的病毒株对这种抑制作用有相同的敏感性；因而需要有另外的C-C趋化因子用作HIV株的抑制剂。更为一般来说，由于趋化因子作为趋化性和炎症介导者的重要性，有必要确认和分离新的趋化因子家族成员，以方便炎症和免疫反应的调节。例如，促进炎症的物质可促进伤口愈合或加速比如从肺炎状态的恢复，发炎对消除感染的重要的。炎症的调节对具明显炎症的病理状态同样重要。节段性回肠炎，表现为肠所有层的慢性炎症，疼痛和腹泻，就是这样的一种病理状态。对节段性回肠炎药物治疗的失败率相当高，该病即使病人接受外科手术后也常复发。对新的趋化因子的确认、分离和特性分析有利于炎症调节。同样地，诱导免疫应答的物质可促使任一种病理状态的缓和或消失。由于白细胞(如中性粒细胞和单核细胞)在细胞介导的免应答中的重要作用，以及趋化因子在白细胞趋化性中的确定作用，有必要识别和分离新的趋化因子，以方便于免疫应答的调节。另外，趋化因子的表达，炎症的条件和疾病状态之间的确定关系，可把趋化因子和能与趋化因子起特异免疫反应的抗体物质，用作诊断和预后的指征；有必要识别和分离新的趋化因子，以方便作诊断和预后的指征。除能吸引和活化白细胞外，某些趋化因子，比如IL-8，能影响非白细胞性细胞的增殖。见塔斯切尔，皮肤病研究杂志，99294-298(1992)。有必要识别和分离新的趋化因子，以促进这些细胞增殖的调节。为前所提的所有理由，需要有重组生产新发现的趋化因子的方法，该法促进涉及趋化因子和趋化因子抑制剂的临床应用。发明概述本发明提供新的纯化和分离多核苷酸和多肽的方法，以满足以上所概括的一种或更多种的需求。例如，本发明提出的纯化和分离的多核苷酸(即，DNA和RNA，正义和反义链)，它编码一种新的C-C亚族的人趋化因子，在此命名为“来自巨噬细胞的趋化因子”或“MDC”。本发明优选的DNA序列包括基因组和cDNA序列，以及化学合成的DNA序列。cDNA核苷酸序列，命名为MDCcDNA，编码该趋化因子，列于SEQIDNO1中，该序列包括5′和3′非编码序列。本发明优选的DNA包含SEQIDNO1的20-298位核苷酸，该核苷酸组成MDC的编码序列。MDC蛋白在氨基端包含推测的24个氨基酸的信号序列。本发明优选的DNA组成SEQIDNO192-298的核苷酸，这些核苷酸包含推测的成熟(分泌)MDC蛋白的编码序列，没有信号序列。趋化因子MDC的氨基酸序列列于SEQIDNO2中。除上述的多核苷酸外，本发明优选的多核苷酸包括能编码列于SEQIDNO2中的氨基酸序列，它与前几节描述的仅由于众所周知的遗传密码简并的多核苷酸不同。同样地，因为SEQIDNO2的24个氨基酸(-24至-1位)组成能裂解产生成熟的MDC趋化因子的公认的信号肽，优选的多核苷酸包括编码SEQIDNO2的1-69氨基酸的部分。这样，优选的多核苷酸是纯化的多核苷酸，它编码的多肽含包括SEQIDNO21-69位氨基酸的氨基酸序列。应用本发明的多核苷酸时可用作杂交探针，识别和分离编码人MDC的基因组DNA，该基因可能含C-C趋化因子基因特有的三个外显子/二个内含子结构(贝巴格欧利尼等，同上)；识别和分离与MDC同源的编码非人蛋白的DNA序列；识别与MDC相似的人和非人的趋化因子，以及识别表达MDC的细胞和该蛋白表达的条件。本发明的杂交探针也有诊断用途，如筛选诸如结肠组织的人组织的炎症。更具体而言，使用MDC多核苷酸杂交探针的杂交研究能区别节段性结肠炎患者的结肠组织(MDC杂交检测上皮，固有层，佩耶(payer’s)斑和平滑肌)与正常人结肠组织(上述背景下不会杂交)。一般来说，本发明的MDCcDNA至少有约14个最好约18个核苷酸的连续部分，对用作本发明的杂交探针是有用的。这样，在一实施方案中，本发明包括的DNA含SEQIDNO1或相应的非编码互补链的核苷酸序列的连续部分，该部分至少含18个核苷酸，该DNA能在严谨条件下与人MDC基因的编码或非编码链杂交。本发明的杂交探针作诊断用途时，更为可取的是表现为对MDC基因序列的杂交专一性。这样，在优选的实施方案中，本发明杂交探针DNAs在严谨条件下不会与其它的人趋化因子基因杂交(如，MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、RANTES基因、MIP-1α基因、MIP-1β基因和I-309基因等)。另一方面，本发明提供纯化的多核苷酸，其在严格条件下能与SEQIDNO1的DNA的非编码链杂交。同样地，本发明提供的纯化的多核苷酸，要不是遗传密码的冗佘性(redundancy)，在严格条件下能与SEQIDNO1的DNA的非编码链杂交。示范性的严格杂交条件如下在5×SSC，20mM磷酸钠，pH6.8，50％甲酰胺中，42℃杂交，在0.2×SSC中42℃下清洗。本领域的技术人员懂得，依据被杂交序列的长度和GC核苷酸碱基的含量变化实验条件，是合乎需要的，有确定这些变化的公式[如见，圣姆布鲁克等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港，纽约冷泉港实验室(1989).]。另一方面，本发明包括掺入了本发明DNA的质粒和病毒DNA载体，包括上述或本文其它地方描述的DNA的任一种。优选的载体包括表达载体，在表达载体中，掺入的编码MDC的cDNA可操作地与内源或异源的表达控制序列相连。以上表达载体可进一步包括操作性地连接编码MDCDNA序列的编码多肽的DNA序列，这种载体可表达产生含重要的MDC多肽的融合蛋白。另一方面，本发明包括用本发明的DNA或载体稳定转染或转化原核或真核宿主细胞。在优选的宿主细胞中，能表达由本发明的DNA或载体所编码的成熟的MDC多肽。本发明的DNA，载体和宿主细胞，对如本发明的MDC多肽的大量重组生产是有用的。这些方法也在本发明之中。例如，本发明包括一种生产MDC的方法，其中本发明的宿主细胞在合适的营养培养基中生长，从细胞或培养基中分离MDC蛋白。再一方面，本发明包括纯化和分离MDC多肽的方法。优选肽是纯化的趋化因子多肽，具有包含SEQIDNO2的1-69位氨基酸的氨基酸序列。本发明的多肽可从天然的材料中纯化，但优选，应用本发明的DNAs，载体和/或宿主，用重组方法生产，或化学合成。本发明纯化的多肽，根据所选的宿主细胞、重组生产的方法、分离方法、处理过程、贮存缓冲液等情况，可以是糖基化或非糖基化的，水溶或不溶，氧化的，还原的等。此外，本发明的一个方面包括MDC多肽类似物，其中是从本发明MDC多肽的一个或多外氨基酸残基添加，缺失或取代而成，类似物保留C-C趋化因子特有的一个或多个生物学活性。MDC的小有利于以上多肽类似物的化学合成，用本文描述的许多活性测定的方法，筛选具MDC的生物活性(如诱导巨噬细胞趋化性的能力，抑制单核细胞趋化性的能力)的类似物。替代方法是这些多肽类似物可用熟知的方法重组产生，如对本发明编码MDC的DNA定点突变。有关的方面，本发明包括从本发明的MDC多肽的一或更多个氨基酸残基被添加、缺失或取代的多肽类似物，该类似物缺乏C-C趋化因子或MDC的生物学活性，但能竞争性或非竞争性地抑制MDC多肽和C-C趋化因子受体的结合。这样的多肽是有用的，如用于调节宿主内源性MDC的生物学活性，也可用于上述医学影像方法。MDC的某些特殊的类似物可设计作调节MDC的结构、分子间结合特性和生物学活性。例如，可特别地设计缺失氨基末端(N-末端)和羧基末端(C-末端)的类似物(截短)改变MDC的结构和功能。另外，可特别地设计下列单氨基酸改变体(单独或结合)(1)非碱性氨基酸分别替换SEQIDNO2的24和27位的碱性精氨酸和/或赖氨酸；(2)带电荷的或极性氨基酸(如丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或半胱氨酸)替换SEQIDNO230位的酪氨酸，替换SEQDNO2的59位的色氨酸，和/或SEQIDNO260位的缬氨酸；和(3)用碱性或不带电荷的小氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸)替换SEQIDNO250位的谷氨酸。具有这些氨基酸改变的特殊类似物包括在下面的通式中(SEQIDNO25)MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065其中24位的氨基酸可选自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中27位的氨基酸可独自地选自赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中30位的氨基酸可独自地选自酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中50位的氨基酸可独自地选自谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸和丙氨酸；其中59位氨基酸可独自地选自色氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中60位氨基酸可独自地选自缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。这些MDC多肽类似物可特别地设计以调节MDC对趋化因子受体和/或其它分子(如肝素、糖胺聚糖、红细胞趋化因子受体)的结合特性，这些特性在MDC呈递给其受体时认为是重要的。在一优选的实施方案中，本发明的MDC多肽类似物包括SEQIDNO25的1-69的氨基酸。已合成的下述另外的类似物，也成为本发明的方面(a)包含鉴定为SEQIDNO30的1-70位的氨基酸序列的多肽；(b)包含鉴定为SEQIDNO2的9-69位的氨基酸序列的多肽；(c)包含鉴定为SEQIDNO31的1-69位的氨基酸序列的多肽；(d)包含鉴定为SEQIDNO32的1-69位的氨基酸序列的多肽。相关的方面是本发明提供纯化和分离编码以上MDC多肽类似物的多核苷酸的方法，这些多核苷酸对如重组方法生产MDC多肽类似物；把以上多核苷酸与质粒和病毒载体连接，用该DNA或载体稳定地转化原核和真核宿主细胞是有用的。另一方面本发明包括能和本发明的MDC多肽和多肽类似物起免疫反应的抗体物质(例如，单克隆和多克隆抗体，单链抗体，嵌合或人源化抗体等)。以上抗体对诸如纯化本发明的多肽，如用熟知的ELISA技术定量测定宿主内源性的MDC和调节MDC对其受体的结合是有用的。本发明进而包括生产本发明抗体物质的杂交瘤细胞系。本发明重组的MDC多肽和多肽类似物象抗体一样可用于结合反应，以识别表达MDC受体的细胞和用标准的克隆表达技术，分离编码受体的多核苷酸。这些MDC多肽，MDC多肽类似物和MDC受体多肽对MDC趋化因子活性的调节，多肽和化学性的(如小分子)MDC激动剂和拮抗剂的鉴别是有用的。本发明的另一方面是有关本发明的MDC多肽和多肽类似物的药学应用。例如，已表明MDC能调节白细胞趋化性。特别地，MDC能诱导巨噬细胞趋化性和抑制单核细胞趋化性。因而一方面本发明包括调节(如上调或下调)哺乳类宿主的白细胞趋化性的方法，含给哺乳类宿主服用本发明的MDC多肽和多肽类似物的步骤、其中MDC多肽或MDC多肽类似物能调节宿主白细胞的趋化性。在优选的方法中，白细胞是单核细胞和/或巨噬细胞。例如，服用实验确定的MDC剂量(如在药学可接受的载体中)，以诱导巨噬细胞趋化性或抑制单核细胞趋化性，而使用抑制性的MDC多肽类似物获得相反的效果。另一方面，本发明提供减轻病人炎性状态的方法，该状态的特征至少是(i)单核细胞向所述的病人炎症位点趋化或(ii)成纤维细胞增殖之一，该方法包括给病人服用MDC治疗有效量的步骤。在一实施方案中，MDC治疗有效量是能抑制单核细胞趋化性的量。在另一实施方案中，MDC治疗有效量是能抑制成纤维细胞增殖的量。这些治疗有效量是用公认技术的剂量反应分析实验确定的。作为附加的内容，本发明提供含本发明MDC多肽或多肽类似物在药学可接受的载体中的药学组合物。同样地，本发明有相关的根据本发明作如炎性疾病状态的疾病状态治疗的组合物应用方法。在一实施方案中，炎性疾病状态的特征是单核细胞向病态的病人中的炎性位点趋化。在另一实施方案中，炎性疾病状态的特征是具病态病人的成纤维细胞增殖。前述的内容和大量的附加内容从下列附图和详述中更为明显。附图简述图1是人MDC(SEQIDNO2)的氨基酸序列和其他以前已描述的人C-C趋化因子的氨基酸序列比较，这些趋化因子是MCP-3[凡戴姆等，实验医学杂志，17659(1992)](SEQIDNO18)；MCP-1[马特苏雪玛等，实验医学杂志，1691485(1989)](SEQIDNO19)；MCP-2(成熟态)[凡戴姆等，同前，常等，国际免疫学，1388(1989)](SEQIDNO20)；RANTES[施查尔等，免疫学杂志，1411018(1988)](SEQIDNO21)；MIP-1β[布朗等，免疫学杂志，142679(1989)](SEQIDNO22)；MIP-1α[内高等，分子细胞生物学，103646(1990)](SEQIDNO23)；和I-309[米勒等，免疫学杂志，1432907(1989)](SEQIDNO24)。斜杠“/”表示公认的信号肽被切割的位点。插入破折号使序列美观整齐。图2是描述在一趋化性分析中，增加MDC浓度对人单核细胞迁移的趋化影响图(用荧光单位计量)。实心圆圈表示来自THP-1细胞系的单核细胞的应答。空心菱形表示对阳性对照，酵母聚糖活化血清(2AS)的应答。图3是描述增加MDC浓度对人多形核(pmn)白细胞迁移的趋化影响图(用荧光单位)计量。实心圆圈表示对MDC的应答，空心菱形表示对阳性对照IL-8的应答。图4是描述增加MDC浓度对巨噬细胞和单核细胞迁移的趋化影响图(用荧光单位计量)。实心圆圈表示来自THP-1细胞系的巨噬细胞对MDC的应答。空心圆表示来自THP-1细胞系的单核细胞对MDC的应答。图5是描述增加MDC浓度对豚鼠腹膜巨噬细胞迁移的趋化影响图(用荧光单位计量)。实心圆圈表示巨噬细胞对MDC的应答。空心三角形表示对阳性对照的酵母聚糖活化血清(ZAS)的应答。图6是描述增加MDC浓度，对由MCP-1诱导的THP-1单核细胞迁移的抑制趋化性影响图(用荧光单位计量)。实心圆圈表示MDC抑制趋化的效果，趋化性已被MCP-1诱导出来。空心圆圈表示在对照实验中，仅用基本培养基(RPMI加0.2％BSA(RBSA)，无MCP-1)时，MDC抑制趋化的效果。X轴上的零点相应于没有任何MDC时，细胞对MCP-1和RBSA的应答。图7是描述增加MDC浓度对成纤维细胞增殖的影响图(用每分计数(cpm)计量)。实心圆圈表示用纯化的从CHO细胞重组生产(参考实施例10F)的MDC的增殖反应。空心圆圈表示用化学合成的MDC(参考实施例11)的反应。图8是用图表示哺乳类表达载体pDC1的结构。发明详述用下列的实施例阐述本发明，有关的人cDNA命名为MDCcDNA，所编码的新的C-C趋化因子命名为MDC(为“来源自巨噬细胞的趋化因子”)。更为详细地，实施例1描述从人巨噬细胞cDNA文库中分离部分MDCcDNA。实施例2描述用从实施例1来的cDNA作探针，从cDNA文库中分离另外的cDNA，这些cDNA之一含全长的MDC编码序列。另外，实施例2提出复合的MDCcDNA核苷酸序列和由此编码趋化因子(MDC)的推导性氨基酸序列的特征。在实施例3中，描述的实验显示在不同的人组织中MDC基因表达的水平。观察到最强的MDC基因表达在胸腺，而可检出的最弱表达在脾和肺组织。实施例4更为详细地描述了在单核细胞成熟为巨噬细胞过程中，和诱导HL60细胞分化成巨噬细胞样的细胞类型时MDC基因的表达。由于在实施例3中MDC基因表达在胸腺和脾中检出，原位杂交研究可进一步对MDC基因在这些组织中表达进行定位。另外，原位杂交显示了MDC基因高表达在肠组织和节段性结肠炎之间的相关性。这些原位杂交实验在实施例5中描述。实施例6描述MDC作为GST融合蛋白在原核细胞中的重组生产，和融合蛋白的切割以及重组MDC纯化的方法。实施例7描述用于重组MDC蛋白表达的替代性DNA构体的构建方法和描述用这种构体转化细菌宿主生产MDC的方法。实施例8提供实验方案对在实施例7中描述生产的重组MDC进行纯化。实施例9和10提供实验方案分别在酵母和哺乳类细胞中进行MDC重组生产。此外，实施例10提供纯化重组MDC的方案。实施例11描述用多肽合成方法生产MDC和MDC多肽类似物。实施例12-17提供方案测定MDC生物学活性。例如，实施例12提供MDC对嗜碱细胞，肥大细胞和嗜酸性细胞影响的测定法。实施例13描述MDC对单核细胞/巨噬细胞，中性粒细胞和粒细胞的化学引诱和细胞活化特性的测定法。实施例14-17提供体内测定MDC生物学活性的案方。实施例14提供MDC抑制肿瘤生长的测定法。实施例15和16提供方案测定分别经腹腔和皮下注射的MDC活性。实施例18提供方案产生和MDC起特异免疫反应的单克隆抗体。剩下的实施例提供另外的MDC活性测定法。例如，实施例19提供钙流测定法，以测定MDC诱导细胞活化的能力。实施例20提供方法测定MDC抗HIV增殖的影响。实施例21说明MDC抗成纤维细胞增殖的影响。实施例22提供体外MDC对其他细胞类型增殖的影响的方法。实施例23提供体内方法测定MDC抗成纤维细胞增殖的影响。实施例24提供方法识别MDC调节因子。实施例1部分C-C趋化因子cDNA的分离新的C-C趋化因子的部分cDNA按下法分离。PolyA+RNA从来源自外周血单核细胞的巨噬细胞中收获。双链，平末端cDNA用体外遗传拷贝试剂盒(圣地亚哥，CA)产生，在插入哺乳表达载体pRc/CMV(Invitrogen)前，把BstXI修饰子连接到cDNA上[见特乔尔克等，自然，374549-552(1995)]。蓝XL1大肠杆菌(stratagene，LaJolla，CA)用质粒cDNA经电穿孔方法转化，植到含100μg/ml羧苄青霉素的986个平板上(约每板3000个转化体)。37℃生长过夜后，每板的细菌刮下形成986个细菌库。用大量微制备DNA纯化系统(普洛麦格，麦迪逊，WI)，根据厂家的说明书，把质粒DNA从986个细菌库中逐个分离。纯化的质粒DNA库按下法进一步鉴定，用于分离单个的DNA克隆来自各个库的质粒DNA用于转化蓝XL1大肠杆菌细胞，植板，按上法生长过夜。随机挑选各个转化体，在添加羧苄青霉素的3mlLB培养基中生长过夜，质粒纯化用Wizard微制备纯化系统(普洛麦格)，作如下改动250mg硅藻土(西格玛化学公司，圣路易斯，MO)加到厂家提供的DNA结合树脂中。纯化的质粒DNA在自动测序仪型号373(应用生物系统公司，福斯特城，CA)上测序，所用的引物是JHSP65′GACACTATAGAATAGGGC3′(SEQIDNO3)该引物能与质粒载体pRc/CMV载体邻近克隆位点的部分杂交。各个cDNAs的核苷酸和推导出的氨基酸序列与核苷酸和肽数据库比较，以确定编码蛋白的哪一个克隆与已知的炎性介导分子相似。序列比较于1994年12月14日由布赖斯特国家中心生物技术信息网络服务部(e-mail“blast@ncbi.nlm.nih.gov”)进行，用艾尔兹邱尔等，分子生物学杂志，215403-410(1990)的排列算法。序列分析显示所分离的巨噬细胞cDNA的一个克隆的一部分，称为pMP390，含基因序列和前已确认的趋化因子基因，包括人MCP-3基因和大鼠MIP-1β基因，有约60-70％的同一性。pMP390的2.85kbcDNA插入片段亚克隆到pBluescriptSK-载体中(Stratagene，LaJollaCA)，从便完全测序。从多聚-A尾巴开始的整套缺失体，用普洛麦格的去-碱基系统(promega′sErase-a-BaseSystem)(MadisonWI)消化形成。缺失质粒重新环化。克隆进大肠杆菌中，纯化，测序用如下表示的M13，T3.1和T7.1引物(SEQIDNO4)M135′GTAAAACGACGGCCAGT3′(SEQIDNO5)T3.15′AATTAACCCTCACTAAAGGG3′(SEQIDNO6)T.7.15′GTAATACGACTCACTATAGGGC3′这pMP390cDNA全序列相当于SEQIDNO1的73-2923位的核苷酸部分(相当于SEQIDNO2-6-69位的推导氨基酸序列)。与数据库序列进行最原始比较的序列相当于SEQIDNO173-610位核苷酸。实施例2含完整MDC编码序列的另外的cDNA克隆的分离用实施例1分离的pMP390cDNA克隆，从同样的人巨噬细胞cDNA文库中分离另外的cDNA克隆，这些另外的cDNA含另外的5′序列，能编码完整的来自巨噬细胞的趋化因子的氨基酸序列。首先，从来自巨噬细胞cDNA文库(实施例1)的986个质粒DNA库中，取40个用PCR筛选，以鉴别感兴趣的含另外cDNA克隆的库。根据实施例1获得的pMP390cDNA序列，构建合成寡核苷酸PCR引物390-1F(称作SEQIDNO7)和390-2R(SEQIDNO8)，以扩增部分由pMP390编码的趋化因子基因的211个碱基对序列390-1F5′TCTATCTAGAGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAAG390-2R5′CACCGGATCCTCATTGGCTCAGCTTATTGAGAA3′引物390-1F相应于SEQIDNO1的91-116位核苷酸，前有限制内切酶XbaI的识别位点，4个附加的碱基便于该酶切割；引物390-2R与SEQIDNO1的301-279位核苷酸互补，加有酶BamHI的识别位点，4个附加的碱基位于侧翼。如XbaI和BamHI切点便于获得片段的克隆。对每一被选的质粒库用50μlPCR反应混合液，含0.2μg质粒DNA；1.5mM氯化镁；50mM氯化钾；10mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.4；0.2mM每一种dNTP；每一引物10μg/ml和0.5μlTaq聚合酶(5U/μl)(伯林格曼海姆生物化学公司(BMB)，Indianapolis，IN)。反应在94℃温育4分钟，然后94℃变性15秒，60℃退火15秒和72℃延伸30秒，循环30次。PCR反应产物通过2％琼脂糖凝胶(生命技术公司，Gaithersburg，MD)，在0.5XTBE缓中液中电泳[圣姆布鲁克等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港，纽约冷泉港实验室(1989)]，用溴化乙锭观察。筛选的40个质粒库中，6个产生一条相当于预期的230个碱基对的PCR片段的强带(预期的PCR片段包括趋化因子基因序列211bp，及侧翼的XbaI和BamHI限制性位点)，表明存在一或更多个含与pMP390有关的基因序列的质粒。为分离以上相关的克隆，从6个阳性的质粒库中选三个等份电穿孔导入大肠杆菌XL-IBlue细胞中，细胞铺于平板上，按实施例1描述的方法生长过夜。克隆转移到硝酸纤维素膜上，按下列标准步骤准备杂交(圣姆布鲁克等，同前)。筛选膜的放射性标记的MDC探针按下法制备含MDCcDNA的2.85kbDNA片段从pMP390中用限制酶消化切得，在TAE缓冲液中用琼脂糖凝胶电泳纯化(圣姆布鲁克等，同前)电洗脱，苯酚和氯仿抽提，乙醇沉淀。纯化片段(250ng)用随机引物DNA标记试剂盒(BMB)，按厂家推荐的方法标记。标记探针过G-50快速旋(QuickSpin)转柱(BMB)纯化。膜和每分钟计数(cpm)为5×107的探针，在40-50ml的溶液中，42℃温育16小时，溶液含50％甲酰胺，5×Denhardt’s溶液，5×SSC(1倍SSC为0.15M氯化钠，15mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠，pH6.5和0.1mg/ml剪切的鲑鱼精子DNA(西格玛，圣路易斯MO)。杂交后，膜在0.2×的SSC中洗三次，在0.2％SDS中55℃洗30分钟。为显影杂交结果，洗过的膜在kodak(罗彻斯特，NK)XAR-5自放射显影片上，用LighteningPlus增感屏(DuPont，DE)-80℃曝光过夜。PCR用于筛选50个杂交细菌克隆。50个含3901F和390-2R引物的PCR反应按上述方法建立，模板DNA用从来自50个克隆的细菌代替。开始时，反应液94℃变性8分钟。然后，按上法进行35个扩增循环。一个单克隆产生预期的230个碱基对的产物；含这克隆的质粒命名为pMP390-12。感兴趣的另外MDCcDNA，用特异对pMP390插入片段的5′端的探针，克隆杂交识别。探针按下法制备含pMP390cDNA(SEQIDNO1的91-298位核苷酸)编码区的211个碱基和邻近3′非编码区的163个碱基的DNA片段，按上述方法用PCR产生，用60ng的pMP390cDNA作模板和合成的寡核苷酸390-1F(SEQIDNO7)和390-4R(SEQIDNO9)作引物390-4R5′AATGGATCCACAGCACGGAGGTGACCAAG3′引物390-4R含BamHI限制性位点及互补于SEQIDNO1461-442位的核苷酸的序列。PCR产物按上述方法电泳纯化，50ng纯化片段用随机引物DNA标记制剂盒(BMB)标记，过G-50快速旋转柱(BMB)纯化。膜按上述方法用该片段探测，在0.4×SSC和0.2％SDS中48℃，洗30分钟，共三次。放射自显影按上述方法进行。5个杂交克隆被检出，命名为MP390A，MP390B，MP390C，MP390D和MP390E。这5个克隆和一个用pMP390-12转化的克隆被分离和繁殖，用Wizard微量制备DNA纯化系统(普洛麦格，麦迪逊，WI)，附加按实施例1所述的硅藻土进行质粒纯化。质粒DNA在应用生物系统型号373的自动测序仪上测序，用合成引物390-3R(SEQIDNO10)390-3R5′AGTCAAGCTTAGGGCACTCTGGGATCGGCAC3′引物390-3R与SEQIDNO1的266-246碱基互补，含一个HindIII限制内切酶切点和在5′端4个附加的碱基对。设计该引物能与引物390-2R上游和SEQIDNO1216位核苷酸下游退火，216位点在能编码本发明的趋化因子的基因组DNA中有一内含子[见戴诺夫等，免疫学杂志，1521182-1189(1994)]。六个克隆中，pMP390-12和pMP390B克隆含最大的附加5′编码序列，每一克隆在以前所获的cDNA克隆pMP390的序列上游额外延长72个核苷酸。复合的DNA序列，在此命名为MDCcDNA，由pMP390和pMP390-12cDNA序列组合后产生。趋化因子MDC的这个2923个碱基对的复合cDNA序列和推定的氨基酸序列，分别列于SEQIDNOs1和2中。推定的氨基酸序列和已知的趋化因子序列人工比较显示MDCcDNA序列编码一种新型的C-C趋化因子，长为93个氨基酸，和其它C-C趋化因子享有28-34％的氨基酸同一性(图1和表1)<p>重要的是，具趋化因子特征的四个半胱氨酸残基在MDC中是保守的。五个附加的残基在图1显示的8个序列中也完全保守。93个氨基酸的MDC序列的前24个氨基酸是明显疏水的，与决定信号切割的Von.Heijne规则[核苷酸研究，144683-90(1986)]相一致。这些特征和图1的多肽比较集中表明MDCcDNA编码的24个氨基酸的信号肽能被切割，产生在SEQIDNO21位以甘氨酸残基开始的MDC成熟态分子。该预测按以下实施例10描述的，在哺乳动物细胞重组产生的MDC蛋白的直接测序所证实。MDC复合的cDNA序列表明在SEQIDNO1序列上预定为甲硫氨酸密码子上游的延伸了19个核苷酸，和终止密码子下游延伸了2.6kb。实施例3MDC基因在人组织中表达的确定进行RNA印迹分析确定MDC基因表达的组织。实施例2中提到的放射性标记的pMP3905′片段(相当于编码公认的MDC成熟态的MDCcDNA区段，外加相连的3′非编码区的163个碱基)，用作探针检测含来自不同正常人组织的RNA的多组织RNA印迹(Clontech，PaloAlto，CA)。使用前将探针煮沸变性，根据厂家的说明书进行杂交。用2个增感屏-80℃曝光5天进行放射自显影。观察到最大的MDC基因表达是胸腺，在脾和肺组织有可检测的较弱表达。来自小肠组织的MDC表达甚至更低，在脑，结肠、心脏、肾、肝、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、骨骼肌、睾丸或外周血白细胞，未检测到表达。实施例4巨噬细胞成熟过程中的MDC基因表达因为编码MDC的cDNAs从人巨噬细胞cDNA文库中分离、所以要检查单核细胞分化成巨噬细胞过程中MDC基因表达。A.来自单个供体的人单核细胞培养在系列组织培养板中，0、2、4或6天后从一板中收集细胞。一般参见埃尔斯特等，免疫学杂志，1401618-1624；特乔尔克等，同上。在这些条件下，4-6天单核细胞分化成巨噬细胞[斯坦福莱尼等，生物化学杂志，2659682-9687(1990)]。从每一时间点收集的细胞中分离RNA(每道10μg)，准备RNA印迹，用上述放射性标记的pMP390片段探查。来自新鲜分离的单核细胞的RNA中，未检测到杂交信号，而培养6天后分化成巨噬细胞的细胞，产生非常强的信号。培养4天的细胞产生较弱的信号，而培养2天的细胞产生的信号，只有膜被延长曝光时间后才可见。B.为进一步证实在分化的人巨噬细胞中的MDC的表达，培养上清液用按以下实施例18所述产生的抗MDC的单克隆抗体western印迹分析。几块板的人巨噬细胞在巨噬细胞集落刺激因子(0.5ng/ml，R&DSystem，Minneapolis，Minnesota)存在下，生长在塑料上分化8天。移去分化的巨噬细胞培养基，重加同样的培养基或含低密度脂蛋白(LDL，西格玛)，氧化的LDL(按马尔顿等，生物化学杂志，26613901(1991)的方法，温育在5μMCuSO4·5H2O中氧化)或地塞米松(6nM，西格玛化学公司)。每一处理进行三天后，取培养液，加盐酸调pH为6.8，过肝素-葡聚糖CL-6B柱(发玛西亚，Piscataway，NJ)。用含0.2M氯化钠的20mM三羟甲基氨基甲烷，pH8洗柱，含0.6M氯化钠的20mM三羟甲基氨基甲烷pH8的溶液洗脱。洗脱的物质在18％的丙烯酰胺SDS-PAGE胶(NOVEX)中分级分离，电印迹到PVDF膜上(Millipore，BedfordMA)。用标准技术(圣姆布鲁克等)，膜被封闭，清洗和与抗MDC的单克隆抗体反应。在每一个分析的培养液中，MDC蛋白在约0.5μg/ml浓度下被检出，由此确认在分化的人巨噬细胞中MDC的表达。MDC的表达也在人上皮细胞系中做了分析。结肠上皮T84细胞系(ATCC#CCL-248)培养在DMEM/F12培养基(GIBCO，GaithersburgMD)中，肺上皮A549细胞系(ATCC#CCL-185)培养在F12培养基中。筛选细胞中存在的MDCmRNA和培养基中的MDC蛋白，按上述用于巨噬细胞的方法进行。在这些细胞系中任一方法均未检出MDC的表达。此外，T84细胞系的试样用肿瘤坏死因子α(5ng/ml，PeproTech，RockyHill，NewJersey)，肿瘤坏死因子-β(1ng/ml，R&DSystems)，或干扰素-γ(200U/ml，PeproTech)，单独或与100ng/ml的重组MDC(来自CHO转染细胞，见实施例10)合用，处理一天。A549细胞系试样用50ng/mlPMA(西格玛化学公司)处理0、1、3、5或7天。当用上述RNA印迹法筛选时，对T84或A549细胞的这些处理没有一个能检出MDCmRNA的表达。C.MDC基因在巨噬细胞中表达的进一步检测用1％DMSO(西格玛化学公司)或50ng/mlPMA(西格玛)处理人细胞系HL60进行。用DMSO处理诱导HL60细胞分化成粒细胞样表型，而PMA诱导HL60分化成巨噬细胞谱系[帕鲁塞等，血液，58836-843(1981)]。RNA从未处理细胞或用DMSO或PMA处理一天或三天的细胞中分离，电泳(每道10μg)和印迹。RNA的Northern印迹探测用实施例3所述的放射性标记的pMP3905′片段。PMA处理三天后，HL60细胞明显地表达MDCmRNA，尽管表达水平明显地比培养6天后的巨噬细胞表达水平低(见上)。处理一天后或未处理的细胞未见到表达。此外，用DMSO处理一或三天，没有可检测的MDC表达被诱导出来。实施例5原位杂交因为MDC基因表达在胸腺和脾中检测到，进行原位杂交以定位这些组织的信息来源。此外，原位杂交用于确定MDC基因表达与节段性回肠炎有关的肠组织炎症相关性。为产生放射性标记的原位杂交探针，含MDC编码区的DNA片段(SEQIDNO1的91-301位核苷酸)亚克隆到pBluescriptSK-载体中。使用T3和T7RNA多聚酶(BMB)，按厂家的说明，把35S-UTP掺入到互补于基因每条链的RNA转录本中。正常人脾、胸腺和结肠组织样品，以及节段性回肠炎患者的结肠组织样品，从国家疾病研究交换处(Philadelphia，PA)获取。组织供体如下正常胸腺19岁男性高加索人，死于机动车祸，尸检时取组织；正常脾51岁黑人男性，死于脑出血，尸检时取组织；正常结肠黑人女性，手术时取组织；节段性回肠炎的结肠1号女性，种族不详，46岁，溃疡性结肠炎患者，手术时取组织；节段性回肠炎的结肠2号18岁男性，种族不详，节段性回肠炎，手术时取组织。除了前面的分析外，从一病人做扁桃体切除术时切取的炎性扁桃体组织，用相当于SEQIDNO1的677-1042位的核苷酸的MDCcDNA非编码部分探查。这部分经MDCcDNA克隆的PCR扩增产生，所用的引物为390-7F(SEQIDNO26)和390-8R(SEQIDNO27)390-7F5′-TATTGGATCGGTTCTAGCTCCGTGTTCTCC3′390-8R5′-CCAAGAATTCCTGCAGCCACTTTCTGGGCTC3′片段亚克隆到pBluescriptSK-载体中，以产生上述的RNA探针。前段所述的组织样品按下法制备作原位杂交。组织样品包埋在“OCT”化合物中(Miles，Inc.，Elkhart，IN)，用恒冷切片机(cryostat)2800E(Leica)切6微米厚的切片。组织切片粘附在用Vectabond(Vector实验室，伯林格姆，CA)包被的载片上，固定在4％多聚甲醛中4℃20分，酒精脱水，用70％甲酰胺和2×SSC70℃变性。杂交反应用放射性标记的合适探针的有义或反义链，载片温育在杂交水溶液中55℃16小时进行，水溶液含50％甲酰胺，0.3M氯化钠，20mM三羟甲基氨基甲烷pH7.5，10％硫酸葡聚糖，1×Denhardt’s溶液，100nM＝硫苏糖醇和5mMEDTA。杂交后，载片在4×SSC和10mMDTT中室温温育一小时。然后在2×SSC中室温；1×SSC60℃；最后在0.1×SSC中室温洗载片。样品用乙醇脱水，然后涂KodakNTB2摄影乳胶，空气干燥2小时，4℃曝光11天，显影，用苏木精/伊红复染。观察反义链(任一探针)的杂交反应显示MDC基因在正常人胸腺的整个皮质细胞中表达，滤泡有弱杂交信号。MDC在胸腺中表达可能显示MDC有T淋巴细胞发育作用。在正常人脾中表达定位在红髓细胞中，而很少的信号在白髓中检测到。在发炎的扁桃体中高表达定位在上皮区，尽管炎性细胞似乎浸润了整个组织样品。来自节段性回肠炎患者的结肠样品在上皮，固有层，佩耶斑和平滑肌细胞中显示杂交反应。相反，正常人结肠在上述细胞中未显示杂交反应。在节段性回肠炎患者的结肠观察到的MDC表达类型与巨噬细胞特异基因，血小板活化因子乙酰解酶(PAF-AH)[特杰尔克等，同前]的表达紧密相关。该结果，结合实施例4显示的数据，表明在病原性炎症中巨噬细胞在体内表达MDCcDNA。此外，在节段性回肠炎病的结肠组织样品的MDC鉴定显示MDC水平(如在病人血液，粪便样品，和/或肠缺损中)与病人的病态或临床预后有诊断相关性。实施例6重组MDC的生产为产生重组MDC蛋白，编码公认是蛋白成熟态的序列用PCR扩增，克隆到pGEX-3X(发玛西亚，Piscataway，NJ)载体中。设计pGEX载体能产生包括由载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入载体克隆位点的DNA片段编码的蛋白的-种融合蛋白。实施例2描述的标准PCR条件再次用于扩增MDCcDNA片段，用引物390-2R和390-FX2(SEQIDNO11)5′TATCGGATCCTGGTTCCGCGTGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA3′引物390-FX2含BamHI限制性位点，接着是编码凝血酶切割位点的序列[常等，欧洲生物化学杂志，151217(1985)]，接着是SEQIDNO1的92-115碱基。凝血酶切割位点如下亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-脯氨酸、其中甘氨酸和脯氨酸MDC成熟态的前二个残基。用凝血酶处理重组融合蛋白预期切割融合蛋白的精氨酸-甘氨酸键，从GST融合蛋白中释放成熟的趋化因子。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，用BamHI核酸内切酶消化，克隆到pGEX-3X的BamHI位点上。该pGEX-3X/MDC构建体转化到大肠杆菌XL-1Blue细胞(Stratagene，LaJollaCA)中，分离各个转化体，培养。来自不同转化体的质粒DNA被纯化，部分用自动测序仪测序，所用的引物GEX5(SEQIDNO12)，能与pGEX-3X载体近BamHI克隆位点杂交GEX55′GAAATCCAGCAAGTATATAGCA3′用该引物获得的序列证实存在以合适方向插入的所需MDC片段。GST-MDC融合蛋白的诱导获取是把转化的XL-1Blue细菌在LB培养基中(添加羧苄青霉素)在37℃下培养，至波长600nM为0.4的合适密度，接着进一步在0.25-1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(西格玛化学公司，圣路易斯MO)下温育4小时。在细菌中以不溶性的包含体产生的融合蛋白，按下法纯化。细胞离心收获；用0.15M氯化钠，10mM三羟甲基氨基甲烷，pH8，1mMEDTA清洗；用0.1mg/ml溶菌酶(西格玛化学公司)室温处理15分钟。超声澄清裂解产物，细胞碎片12,000xg离心10分钟形成沉淀。含融合蛋白的沉淀重悬在50mM三羟甲基氨基甲烷，pH8，和10mMEDTA中，铺展在50％甘油上，6000xg离心30分钟。沉淀重悬在无Mg++和Ca++的标准磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。融合蛋白仍处于不溶状态，约为蛋白质量的80-90％，在变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，以相对分子量33KD迁移。按考马斯染色判断蛋白产量，约每升大肠杆菌培养物100mg。融合蛋白受凝血酶消化，从成熟的MDC蛋白切割GST。消化液(0.5mlPBS中，20-40μg融合蛋白，20-30单位凝血酶(4000U/mg西格玛))室温温育16-48小时，上到变性的SDS-PAGE胶中分离反应产物。将凝胶浸在0.4M氯化钾中显现GST和MDC蛋白带，分别以约26KD和7KD的片段迁移。7KDSDS-PAGE片段的特性用部分氨基酸序列分析证实。首先，蛋白从胶上切下，电洗脱到25mM的三羟甲基氨基甲烷碱和20mM甘氨酸中，收集到ProSpin柱(应用生物系统，福斯特城，CA)中的PVDF膜上。上样进行自动序列分析(应用生物系统型号473A，福斯特城，CA)，结果产生15个残基的序列信息，该序列准确地对应于MDC预定成熟态的预期N端(SEQIDNO2，氨基酸残基1-15)。实施例7细菌MDC表达载体的构建编码预定成熟MDC蛋白的MDCcDNA部分克隆到含阿拉伯糖启动子和pelB前导序列的质粒中[见贝特等，科学，2401041-43(1988)]。更具体地说，MDCcDNA按实施例2所述的PCR法扩增，用约0.1μgpMP390-12作模板和合成的寡核苷酸引物390-2R和390-Pel(SEQIDNO13)390-Pel5′ATTGCCATGGCCGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA3′引物390-Pel含一个NcoI限制性位点，接着是二个胞嘧啶残基，然后是SEQIDNO1的92-115位碱基。预期的232bp的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，用NcoI和BamHI消化，和阿拉伯糖操纵子及pelB前导序列(贝特等，同前)一起克隆到pUC19载体(新英格兰生物实验室，倍维菜，MA)中。得到的构建体，命名为P2-390，编码pelB前导序列(由载体编码)的融合部分为成熟的MDC蛋白。这构建体的序列用自动序列测定法证实，用引物Ara1(SEQDNO28)和Ara2(SEQIDNO29)，引物能与载体克隆位点邻近部分退火。Ara15′GCGACTCTCTACTGTTTCTC3′Ara25′-CACAGGAAACAGCTATGACC3′用标准操作法，质粒P2-390转化进大肠杆菌MC1061株中，挑选产生MDC的氨苄青霉素抗性克隆。克隆培养在3升发酵器(Applikon，福斯特城，CA)中，MDC的产生加50％阿拉伯糖至终浓度0.1％时被诱导出来。在阿拉伯糖存在下温育一天后，收获细胞。Western印迹显示MDC存在在细胞中的水平约每克湿细胞4μg，分泌到培养基的水平为约1μg/ml。实施例8从细菌和培养基中纯化重组MDC下面的实验方案纯化实施例7所述产生的重组MDC。分泌的重组MDC蛋白从细菌培养基中纯化，如可采用过去描述过的纯化重组产生的RANTES趋化因子[库那等，免疫学杂志，149636-642(1992)]，MGSA趋化因子[赫鲁克等，生物化学杂志，268541-46(1993)]，和IP-10趋化因子(在昆虫细胞中表达)[塞莱斯等，实验医学杂志，1781127-1132(1993)]的方法。实施例9MDC在酵母中的重组生产下面的方案进行MDC在酵母中重组表达和重组MDC的纯化。MDCcDNA的编码区从pMP390-12用PCR扩增，所用的引物是含存在引物390-1F和390-2R的MDCcDNA序列的合成寡核苷酸。编码酵母pre-pro-alpha前导序列的DNA从酵母基因组DNA在PCR反应液中扩增，用含α接合因子基因的1-20位碱基为一引物，另一引物是与该基因255-235位碱基互补的序列[科简和赫斯科威兹，细胞，30933-943(1982)]。pre-pro-alpha前导编码序列和MDC编码序列片段连接到含酵母乙醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，以使启动子指导由pre-pro-alpha因子融合成熟MDC多肽组成的融合蛋白的表达。在罗斯和布洛奇，MethEnz.185234-279，D.Goeddel，ed.，科学出版公司，圣地亚哥，CA(1990)的方法指导下，载体进一步包括克隆位点下游的ADH2转录终止子，酵母“Z-微粒”复制起点，酵母leu-2d基因，酵母REP1和REP2基因，大肠杆菌β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点。β内酰胺酶和leu-2d基因分别在细胞和酵母中选择表达。leu-2d基因也有利于增加质粒在酵母中的拷贝数，诱导高水平的表达。REP1和REP2基因编码涉及质粒拷贝数调节的蛋白。前段所述的DNA构建体，用已知的方法如乙酸锂处理[斯蒂斯等，Meth.Enz.同上，pp.280-297]转化进酵母细胞。ADH2启动子诱导依赖于生长培养基中葡萄糖耗竭[普赖斯等，基因，55287(1987)]。pre-pro-alpha序列影响融合蛋白从细胞中分泌。同时，酵母KEX2蛋白把pre-pro序列从成熟的MDC趋化因子上切割下来[皮特等，美国国家科学院院报，815330-5334(1984)]。另外，用商业化的表达系统，如Pichia表达系统(Invitrogen，圣地亚哥，CA)，按厂家的说明进行MDC在酵母中重组表达。该系统也依赖pre-pro-alpha序列指导分泌，但插入片段的转录由甲醇诱导的酒精氧化酶(AOX1)启动子所驱动。分泌的MDC从酵母生长培养基中纯化，如用从细菌和哺乳细胞上清纯化MDC的方法(见实施例8和10)。实施例10MDC在哺乳动物细胞中重组生产按下列步骤MDC在哺乳动物细胞中重组表达。A.表达载体390HXE的合成MDCcDNA的截短译本按实施例2所述的PCR法合成，用pMP390-12作模板和合成的寡核苷酸390RcH和390RcX作引物。(SEQIDNO14)390RcH5′GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA(SEQIDNO15)390RcX5′TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG引物390RcH含HindIII限制性位点，接着是SEQIDNO1的1-20位碱基；引物390RcX含XbaI限制性位点，接着是与SEQIDNO1的403-385位碱基互补的序列。预期的423bp的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳纯化，克隆到HindIII/XbaI消化的pRc/CMV载体中((InVitrogen，圣地亚哥CA)允许在哺乳细胞中直接表达的载体)。得到的质粒，命名为390HXE，含SEQIDNO1的1-403位碱基。插入的序列用自动测序法证实，所用的引物是DC03(SEQIDNO16)和JHSP6。DC035′CGAAATTAATACGACTCACT3′引物DC03能与pRc/CMV载体邻近克隆位点的序列退火。B.表达载体390HmX的合成另一个MDCcDNA构建体用PCR产生，用pMP390-12作模板，引物是390RcH和390mycRX(SEQIDNO17)。390mycRX5′TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTATTGAGAAT3′引物390mycRX含XbaI限制性位点，互补于编码“myc”表位序列[富尔克斯等，生物技术，13422-427(1992)]的序列，和互补于SEQIDNO1的298-278位碱基的序列。该反应扩增出预期的354bp片段，该片段含SEQIDNO1的1-298位碱基和在MDC羧基端融合“myc”表位。这表位能用于方便作免疫沉淀，亲和纯化和western印迹法检测MDC-myc融合蛋白。片段克隆到pRc/CMV以产生390HmX质粒。插入的序列用引物DC03，自动测序法证实。C.MDC在293T和NS0细胞中表达二种转染方案用于表达上述A.和B.亚部分的二个MDCcDNA构建体瞬间转染到人胚肾293T细胞系和稳定转染到鼠骨髓瘤NS0细胞系(ECACC85110503)。293T细胞的瞬间转染用陈和欧克雅玛，生物技术，6632-638(1988)和分子细胞生物学，872745-2752(1987)的磷酸钙沉淀方法进行。细胞和上清于转染后四天收集。Northern印迹的准备是来自每一细胞裂解物的4μg总RNA，用PCR制备的放射性标记的MDC片段探查。标记反应的模板是前述的用引物390-1F和390-4R(见实施例2)扩增pMP390产生的PCR片段。约30ng该片段用于PCR反应，反应液含如下1.5mM氯化镁，50mM氯化钾，10mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.4，0.2mM脱氧腺苷酸三磷酸，0.2mM脱氧胸苷三磷酸，0.2mM脱氧鸟苷三磷酸，1μM脱氧胞苷三磷酸，50μCiα32P-脱氧胞苷三磷酸(DuPont/NewEnglandNuclear，波士顿MA)，2.5UTaq聚合酶和10μg/ml每一引物390-1F和390-2R。反应液在94℃加热变性4分钟，接着按实施例2所述方法扩增15个循环。探针过G-25快速旋转柱(BMB)纯化。杂交条件在实施例2中已述。膜接着在0.5×SSC中洗和42℃2％SDS中洗30分钟。放射自显影在-80℃用一个增感屏进行16小时。MDCDNA构建体在转染细胞中高表达，在非转染细胞中检测不出来。为稳定转染体，NS0细胞在D-MEM(Gibco)中生长到80％汇合密度，离心收集，用PBS清洗。20μg质粒DNA用ScaI限制酶(BMB)切成线性，加到细胞上，在一0.4cm间隙(gap)小杯(BioRad，HerculesCA)中冰上温育15分钟。细胞电穿孔用1.5千伏3微法的二次脉冲。细胞稀释到20mlD-MEM中，5％CO237℃中培养24小时，用含800μg/mlgeneticin的D-MEM不同的稀释度植到96孔板中筛选。含单个抗药克隆的孔在选择性培养基中扩大培养。总RNA按前段所述的Northem印迹法分析。MDC的信息只在转染细胞系中可见。MDC从哺乳动物细胞培养上清中纯化，如采用纯化重组TCA3趋化因子[威尔逊等，免疫学杂志，1452745-2750(1990)]，或下面F亚部分所述的方法。D.MDC在CHO细胞中表达用引物390RcH和390RcX(SEQIDNOs14和15)，按上述A亚部分所述的方法，PCR扩增MDCcDNA克隆的1-403位碱基。片段克隆到表达载体pDC1的HindIII和XbaI位点之间，pDC1是pUC19的衍生体，含驱动插入片段表达的巨细胞病毒(CMV)的启动子。更具体地说，pDC1载体，图示在图8中，衍生自pRc/CMV和pSV2-dhfr(ATCC载体#37146)。载体pDC1与哺乳表达载体pRc/CMV(Invitrogen，圣地亚哥)相似，除了在新霉素磷酸转移酶基因部位，pDC1携带鼠二氢叶酸脱氢酶(dhfr)基因为选择标志。在pDC1中靶基因的转录在CMV强启动子控制之下。见斯特恩伯格等，病毒学杂志，49190-199(1984)。此外，来自牛生长激素基因[古德温和罗特曼，生物化学杂志，26716330-16334(1992)]的多腺苷化序列接在靶基因的3′端。dhfr表达盒[萨伯拉曼尼等，分子细胞生物学，1854-864(1981)]允许缺乏有功能的dhfr基因的细胞选择pDC1。用CaCl2温育和热休克的标准技术(圣姆布鲁克等)，XL-1蓝细菌(Stratagene)用pDC1/MDC转化。转化体生长在含100μg/ml羧苄青霉素的LB培养基中。从单独转化克隆来的质粒DNA，用普罗麦格(promega)WizardMaxiprep系统(麦迪逊，WI)分离，其序列用引物390-IF和390-2R自动测序证实。质粒用PvuI内核酸酶(BoehringerMannheim)经限制性消化成线性，该酶在载体序列中仅切割一次。用于MDC生产的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系是DG-44，缺失dhfr基因产生。见厄洛伯等，细胞，33405(1983)。电穿孔时，107的这些CHO细胞用PBS清洗，重悬浮在1mlPBS中，和25μg被线性化的质粒混合，转移到一0.4cm小杯中。悬液用BioradGenePulser(Richmond，CA)在290伏，960微法下电穿孔。转化体生长在含10％透析胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)，缺次黄嘌呤和胸腺嘧啶的α-培养基(Cat.NO.12000，Gibco，Gaithersburg，MD)中选择。来自几百个转化克隆的细胞混合，重新在含20nM氨甲喋呤(西格玛，圣路易斯，MO)的α-培养基中库存和再接种。分离在这轮选择中存活的克隆，在含20nM氨甲喋呤的α-培养基中扩大培养。E.作蛋白测序用的MDC的纯化转染的CHO克隆在α-培养基中，生长在塑料组织培养皿上到约90％汇合密度，在那时培养基用含0.2％-1.0％FBS的P5培养基更换。P5培养基由以下表2(以预先混合的粉末购自Hyclone，LoganUT)所列的组分组成，添加以下额外的组分(1)3g/l碳酸氢钠(西格玛，圣路易斯，MO)；(2)2μg/l亚硒酸钠(西格玛)；(3)1％大豆水解物(QuestIntemational，Naarden，TheNetherlands)；(4)1×硫酸亚铁/EDTA溶液(西格玛)；(5)1.45ml/lEX-CYTEVLE溶液(Bayer，Kankakee，IL)；(6)10μg/ml重组胰岛素(Nucellin，EliLily，Indianapolis，IN)；(7)0.1％普卢兰尼克F-68(西格玛)；(8)30μg/ml甘氨酸(西格玛)；(9)50μM乙醇胺(西格玛)；(10)1mM丙酮酸钠(西格玛)；培养额外的二天后，每一上清等分级分和等体积的丙酮混合。沉淀的蛋白离心沉淀，在18％三羟甲基氨基甲烷甘氨酸胶(NOVEX)中分级分离，印迹到PVDF膜上(Millipore，贝德福德，MA)。结合在膜上的MDC用粗制备的抗MDC的单克隆抗体(按实施例18所述制备)检出。分泌高水平MDC蛋白(约1μg/ml)的克隆细胞，用0.5％胰蛋白酶和5.3mMEDTA(GIBCO)的溶液处理，从板上分离，用于加10％胎牛血清(FBS)的α-培养基中进行悬浮培养。过8天时间，加5倍体积的P5培养基到培养物中。加聚乙二醇(MW8000，UnionCarbide，Danbury，CY)到培养血清至20％(重量/体积)，蛋白从培养血清中沉淀，在18％三羟甲基氨基甲烷甘氨酸胶中分离，在CAPS缓冲液(3-[环己胺基]-1-丙磺酸，pH10.4)(西格玛，圣路易斯，MO)中电转离到PVDF膜上(Millipore，贝德福德，MA)。切下膜上的一条带，用产生抗MDC单克隆抗体(见实施例18)的杂交瘤细胞系的上清，蛋白印迹法检测MDC。以表观分子量6.4KD迁移的反应带从膜的残余部分切下。用自动测序仪(应用生物系统，型号473A，福斯特城，CA)，测定蛋白N端的序列是GPYGANMEDS。这序列与SEQIDNO2的1-10位残基相同，与MDC预定成熟态的N端一致。F.作生物学测定用的MDC的纯化作较大规模的培养生长，表达MDC的CHO细胞在α-培养基中，生长在组织培养板上至80％汇合密度，用胰蛋白酶和EDTA处理，细胞从板上分离，在加1％FBS的P5培养基中，以3×105细胞/ml的密度37℃重悬在螺口培养瓶中。需要时添加P5/1％FBS培养基，保持细胞密度在1×106～3×106范围。经11天培养后，细胞通过过滤从培养基中分离。调培养基的pH至6.8，培养基过肝素-葡聚糖CL-6B柱(法玛西亚，Piscataway，NJ)。用0.2M氯化钠的磷酸钾缓冲液，pH7，清洗后，柱用0.2-0.7M氯化钠的线性梯度溶液洗脱。分离的级分用SDS-PAGE分析，考马斯染色确定哪一部分含MDC。约在0.6M氯化钠中，MDC从柱上洗脱。混合含MDC的级分，用能滤过(cutoff)分子量3KD的滤膜在搅拌室腔(Stirred-cellChamber)中(Amicon，Beverly，MA)超过滤浓缩。加辛基葡糖苷(终浓度10mM，BoehringerMannheimBiochemicals)到浓缩的MDC中，接着过SephacrylHR100柱(法玛西亚，Piscataway，NJ)级分用SDS-PAGE分析，以确定MDC的存在。MDC蛋白的终产量约为每升培养上清0.1mg，按考马斯染色判断估计，其纯度在95％以上。实施例11肽合成法生产MDC和MDC类似物MDC和MDC多肽类似物用肽化学合成法制备，所用的技术已成功用于其他趋化因子如IL-8[克洛克-李威斯等，生物化学杂志，26623128-34(1991)]和MCP-1的生产。这些方法具有优势是因为对象趋化因子这样的短序列的蛋白，它们快速，可靠，能选择性地导入新的，非天然的氨基酸和其它化学修饰物。例如，MDC和MDC类似物的化学合成，可用优化的逐步固相法[舒诺齐等，Int.J.Pept.ProteinRes.，40180(1992)]根据梅里菲尔德[J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)]的叔丁氧羰基化学原理，在应用生物系统430A肽合成仪(福斯特城，CA)上进行。用反相的HPLC纯化蛋白，其标准方法的特征包括电喷射质谱学和核磁共振。化学合成的MDC与重组MDC的成熟态一致，由SEQIDNO2的1-69位残基组成。几种方法用于化学合成的MDC与实施例10所述的CHO转染细胞产生的重组MDC相比较。在变性SDS-PAGE(18％三羟甲基氨基甲烷甘氨酸凝胶，NOVEX)中，化学合成的MDC的迁移率与重组MDC相同。此外，在蛋白印迹分析中，用以下实施例18所述的抗细菌产生的MDC的单克隆和多克隆抗体，这些蛋白反应相似。在用抗MDC的单克隆抗体免疫沉淀分析中，化学合成的MDC也以重组MDC相同的方式表现。这些研究显示化学合成MDC的变性和非变性结构与重组MDC的这些结构相似。以下的MDC类似物也已化学合成1)“MDC(n+1)”(SEQIDNO30)由亮氨酸接着是SEQIDNO2的1-69位残基组成。2.“MDC(9-69)”由SEQIDNO2的9-69位残基组成。3.“MDC-yl”(SEQIDNO31)由SEQIDNO2的1-69位残基组成，其中有如下替换59-60位残基(Trp-Val)用Tyr-Leu序列取代。4.“MDC-eyfy”(SEQIDNO32)由SEQIDNO2的1-69位残基组成，其中有如下替换28-31位残基(His-Phe-Tyr-Trp)用Glu-Tyr-Phe-Tyr序列取代，此序列来自趋化因子RANTES的氨基酸序列(SEQIDNO21的26-29位于残基)。预期类似物“MDC(n+1)”，“MDC(9-69)”和“MDC-yl”是MDC活性的拮抗剂，通过竞争性地结合识别MDC的相同受体而抑制MDC活性。另外的可能是类似物能和天然的MDC形成异二聚体产生抑制作用。“MDC-eyfy”类似物的可能活性包括前述类似物的MDC抑制作用。相反，“MDC-eyfy”表现为天然MDC相似的特性。该类似物的其他活性可能包括趋化因子RANTES的典型功能，如淋巴细胞，单核细胞或嗜酸性细胞的趋化性。另外，可特别地设计下列单氨基酸变异体(单独或结合)(1)非碱性氨基酸分别替换SEQIDNO224和27位的碱性精氨酸和/或赖氨酸；(2)带电荷的或极性氨基酸(如丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或半胱氨酸)替换SEQIDNO230位的酪氨酸，替换SEQIDNO259位的色氨酸、和/或SEQIDNO260位的缬氨酸；(3)碱性或不带电荷的小氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸)替换SEQIDNO250位的谷氨酸。具有这些氨基酸改变的特殊类似物包括在下表中(SEQIDNO25)MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTYrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065其中24位的氨基酸可选自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中27位的氨基酸可独立地选自赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸；其中30位的氨基酸可独立地选自酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中50位的氨基酸可独立地选自谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸和丙氨酸；其中59位的氨基酸可独自地选自色氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸；其中60位的氨基酸可独立地选自缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。这些MDC多肽类似物可特别地设计调节MDC对趋化因子受体和/或其它分子(如肝素、糖胺聚糖、红细胞趋化因子受体)的结合特性，这些特性在MDC呈递给其受体时认为是重要的。如前面实施例所述的重组技术也可设计作制备MDC多肽类似物。更具体地说，用熟知的技术如定点突变和聚合酶链反应修饰编码MDC的多核苷酸，以编码感兴趣的多肽类似物。一般参见圣姆布鲁克等，同前，第15章。修饰过的多核苷酸重组表达，按前面实施例所述的方法纯化重组的MDC多肽类似物。MDC或MDC多肽类似物对涉及炎症过程的一种或更多种细胞类型(如T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞或其他细胞)的化学引诱和/或活化细胞的特性，通过确认的已用于许多其它的趋化因子的技术分析。在前面实施例所述的一种或更多种方法纯化和分离的天然MDC、重组MDC或MDC多肽类似物、或合成的MDC或合成的MDC多肽类似物、按下面所述的关于MDC的实施例分析其活性。实施例12MDC对嗜碱性细胞、肥大细胞和嗜酸性细胞作用的测定分析MDC对嗜碱性细胞、肥大细胞和嗜酸性细胞的影响，如用韦伯等，免疫学杂志，1544166-4172(1995)所述的测定MCP-1/2/3活性的方法。用这些方法，测定细胞胞液游离钙的变化和前炎性(proinflammatory)介质(如组胺和白三烯)的释放。阻断趋化因子介导的这些种类细胞的活化涉及迟发变态反应的处理，在迟发变态反应中，前炎性介质的分泌起重要的作用[韦伯等，同上]。实施例13MDC对人单核细胞/巨噬细胞和人中性粒细胞的化学引诱和细胞活化特性的分析MDC对人单核细胞/巨噬细胞和人中性粒细胞影响的评价，如用戴维等，免疫学杂志，1535376-5383(1995)描述的评价鼠TCA3诱导的中性粒细胞和巨噬细胞活化的方法。在上述研究中测定的活化指数包括因整合素活化增加对纤维蛋白原的粘附，化学趋化性，诱导活性氮中间体，呼吸爆发(超氧化物和过氧化氢的产生)，和在细胞松驰素B存在下溶菌酶和弹性蛋白酶的胞吐作用。如同戴维等讨论一样，这些活性与白细胞对炎症应答的不同阶段有关。白细胞的这种应答，按斯普林杰，细胞，76301-314(1994)的综述，涉及白细胞对血管内皮细胞的粘附，通过内皮层的迁移，对趋化因子源的趋化性和炎性介质特定位点的释放。在这些阶段的任一个涉及MDC会是临床介入，调节炎性应答的重要靶点。用一公认技术的趋化反应测定法，为修改的Boyden室法，被测的白细胞在室温下和Calcein温育20分钟标记上荧光。标记细胞用无血清的RPMI洗二次，重悬于含2mg/ml的BSA的RPMI中，然后定量加到室的上孔中，上孔与下孔被聚碳酸酯膜(NeuroprobeInc.CabinJohn，MD)分开。用与白细胞相同的培养基稀释的MDC，以不同浓度加到下孔中。室在37℃下温育2小时。方法的结束部分是未迁移穿过膜的细胞，在用PBS洗膜和橡皮刮刀(policeman)刮后移开。迁移过膜的细胞在荧光板读数计(Cytofluor，MilliporeInc，波士顿，MA)中读取每孔的荧光值定量。使用公认技术的方法，进行一系列实验以确定MDC的趋化特性。开始时，测定人单核细胞对MCD的反应。MDC对多形核白细胞(粒细胞)趋化反应的影响也作了检测。已经证实C-C趋化因子MCP-1，引起单核细胞募集和活化，但诱导巨噬细胞迁移的能力显得有限。MCP-1不能吸引巨噬细胞似乎与分化过程有关当单核细胞分化时，逐渐降低细胞对MCP-1的应答[戴赫尔姆和斯坦克斯，细胞因子，7436-440(1995)]。MCP-1的生物学活性似乎与趋化因子的表达相关，在单核细胞中存在的MCP-1mRNA，当这些细胞分化时降低。MCD的表达类型似乎与所述的MCP-1的情况相反，当单核细胞分化成巨噬细胞时，MDCmRNA的数量增加。为确定是否该表达类型与对MDC的生物学应答相关，比较了MDC对单核细胞和巨噬细胞迁移的影响。在趋化性和抑制趋化性的测定中，分析了许多不同类型的白细胞。用本领域已知的方法[戴赫尔姆等，美国病理学杂志，135571-580(1989)]，从外周血中分离了人单核和多形核白细胞。其次，使用了人单核细胞系，THP-1(从ATCCRockville，MD)获取，在含10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI中维持培养)。THP-1能以单核细胞的形态培养，或用乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)处理能诱导分化成巨噬细胞[戴赫尔姆和斯坦克斯，细胞因子，7436-440(1995)]。一些实验用单核的THP-1细胞，其他实验单核THP-1细胞和乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)温育分化成巨噬细胞。第三，豚鼠腹膜巨噬细胞基本按尤悉穆拉，免疫学杂志，1505025-5032(1993)的方法得到。简言之，收获细胞前二天，给动物腹腔注射3％无菌的硫羟乙酸(thioglycollate)(DIFCO)用含1mMEDTA和0.1％葡萄糖的磷酸盐缓冲液(PBS)灌洗，从腹腔获取巨噬细胞。细胞离心洗一次，然后用于以下所述的趋化性测定。趋化活性测定，用上述制备的细胞，基本上按戴赫尔姆和斯坦克斯，Cytometry，19366-369(1995)所述的方法，用96-孔室(NeuroprobeInc.CabinJohn，MD)以及细胞用荧光染料，Calcein(分子探针，Eugene，OR)进行。测定时所用的聚碳酸酯膜是无PVP的(NeuroprobeInc.)；用于不同类型细胞的膜孔大小是单核细胞和THP-1细胞为5μm，多形核白细胞为3μm，豚鼠巨噬细胞为8μm。5万个Calcein标志的细胞重悬在含2mg/mlBSA的RPMI培养基中，放入上孔。MDC或其他测试物质用含BSA的RPMI稀释(如，MDC终浓度为25、50、100、250ng/ml)，放入下孔中。接着37℃温育2小时，擦去仍在膜上的未迁移细胞，然后让膜空气干燥。这些测定的对照是含BSA的RPMI为阴性对照，50ng/mlMCP-1和1％酵母聚糖活化血清(ZAS，按[戴赫尔姆和利威斯，美国病理学杂志，126464-474，(1987)]所述的方法制备)用作阳性对照。细胞的迁移率在荧光板读数计(Cytofluor，MilliporeInc.Bedford，MA)上定量，迁移的细胞数以荧光单位表示。抑制活性测定中，在室上孔的细胞悬浮在不同浓度(0.005、0.05、0.5、5.0和5ng/ml)的MDC中。室的下孔注满仅为培养基或培养基加趋化因子，MCP-1或酵母聚糖活化血清(ZAS)。比较缺MDC时迁移到MCP-1或ZAS的细胞数与增加MDC浓度迁移的细胞数，估计抑制率。细胞的制备和测定的定量严格按上述趋化测定方法操作。迁移的细胞数以荧光单位表示。如图2所示，MDC不能诱导来自THP-1的单核细胞迁移，但在10～100ng/ml浓度内较明显地抑制单核细胞的迁移。其它C-C趋化因子，如MCP-1和RANTES，在该浓度范围典型地诱导最大的单核细胞趋化性。如图3所示，浓度为0.001～100ng/ml的MDC对粒细胞迁移率没有净影响。除了缺乏对粒细胞趋化性影响外，MDC与其它前述的C-C趋化因子相似。巨噬细胞和单核THP-1细胞对MDC的应答用图4表示。巨噬细胞(实心圆圈)以剂量依赖的方式向MDC迁移，最适活性为50ng/ml。巨噬细胞对较高浓度(100ng/ml)的MDC趋化应答的降低反映了细胞的脱敏作用，这是大多数趋化因子在高浓度时的特征[福尔克和列纳德，InfectInmunol.32464-468(1981)]。不过，单核THP-1细胞(空心圆圈)没有向MDC迁移。MDC对巨噬细胞的趋化活性进一步用激活的豚鼠腹腔巨噬细胞的实验证实。浓度为100～500ng/ml的MDC诱导豚鼠巨噬细胞以剂量依赖性迁移(图5)。诱导豚鼠巨噬细胞迁移所需的浓度约为对人细胞(图4)起作用浓度的10倍。对其它物种人趋化因子的最高生物活性所需的浓度，MCP-1有相似的差别，该结果已由尤悉穆拉，免疫学杂志，1505025-5032(1993)报道。这些实验结果表明MDC的生物学活性与单核细胞向巨噬细胞的分化有联系。与MCP-1相比[尤悉穆拉，免疫学杂志，1505025-5032(1993)]，MDC诱导巨噬细胞而不是单核细胞的趋化性。MDC吸引巨噬细胞的能力显示该趋化因子可能在诱导组织巨噬细胞的病灶性累积中起作用。组织巨噬细胞在特殊区域的累积在肉芽肿形成中是重要的，肉芽肿形成时肺巨噬细胞包围和包裹异物或相对非破坏性的细菌病原如分支杆菌而起作用[亚当斯，美国病理学杂志，84164-191(1976)]。在某些情况下如关节炎，已了解巨噬细胞的累积是有害的，具有破坏性。MDC能促进巨噬细胞趋化性显示本发明的MDC抑制剂有治疗效用，以预防、降低或消除巨噬细胞在组织中累积。图2表示的用人单核细胞的趋化性测定结果暗示MDC能抑制细胞迁移。如图6所示(MDC为0ng/ml)缺乏MDC时，单核THP-1细胞向MCP-1的迁移。不过，当细胞和MDC存在时，对MCP-1的趋化应答(实心圆圈)降低。浓度为0.005-0.5ng/ml的MDC抑制单核细胞对MCP-1的趋化应答。尽管MDC抑制单核细胞对MCP-1的趋化应答，在存在或缺乏MDC时，从向仅为培养基(空心圆圈，RPMI含BSA)迁移的细胞数看，MDC对趋化动力学或随机迁移都没有明显的影响。MDC对单核细胞趋化性的抑制活性显示MDC在处理几种慢性炎性病态(动脉粥样硬化、关节炎、肺纤维化)的治疗效用，在这些病态中，单核细胞的趋化性似乎起重要的病原作用。增强MDC在以上疾病中的活性可导致降低单核细胞对组织的迁移性，从而减少疾病症状的严重程度。实施例14MDC体内肿瘤生长抑制作用的测定MDC抑制肿瘤生长特性的分析，如修改自兰宁等，免疫学杂志，1534625-4635(1995)所述的分析鼠TCA3的抑制肿瘤特性的方法。编码MDC的cDNA电穿孔法转染进来自骨髓瘤的J558细胞系(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)。筛选MDC产生的转染体用标准技术如ELISA(酶联免疫吸附法)，采用实施例18细述的抗MDC的单克隆抗体。来自产生MDC克隆的一千万细胞的团块皮下注射到BALB/c小鼠的右下四分体中。为了比较，一千万非转染细胞注射到对照鼠中。比较两组肿瘤形成的速度和发生率确定MDC抑制肿瘤生长的功效。随后和肿瘤细胞有关的细胞浸润物的特点用组织学方法辨认。此外，重组MDC(20ng)和非转化J558细胞混合，注射(20ng/天)到形成自以上细胞的肿瘤中，以分析给与外源的MDC对肿瘤细胞的影响。实施例15腹膜内注射测定按洛等，免疫学杂志，1534616-4624(1994)所述的方法，通过注射1-1000ng纯化的MDC到小鼠或其它动物(如兔或豚鼠)的腹膜内腔中，确定体内对MDC起应答的细胞。注射后，白细胞从外周血和腹膜腔中分离，用DiffQuick试剂盒(Baxer，McGraw，IL)染色识别。白细胞的全貌是在不同时间估计不同细胞类型出现的动力学测定。在单独的实验中，抗MDC(实施例18)的中和抗体和MDC一起注射，以证实白细胞的浸润是由于MDC的活性所致。实施例16体内活性测定-皮下注射MDC化学引诱物特性的体内测定，采用梅拉等，实验医学杂志，1781913-1921(1993)所述的方案。重组MDC(10-500pmol/点)注射到合适的哺乳动物如狗或兔的皮下。在4-24小时，组织法估计注射点的细胞浸润。用直接抗MDC的抗体免疫组织化学法证实存在MDC。细胞浸润物的特点用Baxer’sDiffQuick试剂盒染色识别。实施例17脊髓抑制活性测定MDC脊髓抑制活性的测定，注射MDC到小鼠或另外的哺乳动物(如兔、豚鼠)中，如用梅兹等，免疫学杂志，1491004-1009(1992)所述的测定MIP-1α的脊髓抑制作用的方法进行。单剂量0.2-10μg的重组MDC静脉注射到C3H/HeJ小鼠中(杰克逊实验室，BarHarborME)。测定在股骨髓和脾中髓样祖细胞的循环效率(cyclingrate)确定趋化因子的骨髓抑制效应。祖细胞生长和分裂的抑制作用在临床上与对接受化学治疗或放射治疗的病人的处理有关。以上趋化因子处理的脊髓保护效应已由达洛普等，血液，792221(1992)在临床前模型中阐明。以前述对趋化因子衍生物白细胞介素-8(IL-8)和血小板因子4(PF-4)相同的方式，体外测定法也用于测定MDC对脊髓抑制的影响。见戴利等，生物化学杂志，2702382(1985)。简言之，为估计粒-巨噬前体细胞，在缺乏(对照)或存在MDC时，低密度(少于1.077g/cm)的正常人骨髓细胞植板于含10％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)，100units/ml的重组人GM-CSF(R&DSystems，Mineapolis，MN)，50ng/ml重组人青灰(Steel)因子(ImmunexCorp，Seattle，WA)，0.3％的琼脂培养基中。为估计红系粒细胞髓系巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)和红系簇形成单位(BFU-E)，在存在重组人红细胞生成素(1-2units/ml)及与50ng/ml青灰因子合用下，细胞生长在含0.9％甲基纤维素的培养基中。在37℃低氧(5％)培养14天后，数个板上得到了集落。GM-CSF和青灰因子或红细胞生成素和青灰因子的合用使能检出大集落(通常＞1000细胞/克隆)，这些集落来自粒细胞髓系集落形成单位(CFU-GM)，CFU-GEMM和BFU-E的早，更不成集的子集合。实施例18抗人MDC的抗体A.单克隆抗体重组MDC，按实施例6所述的切割GST-MDC融合蛋白的方法产生，用于免疫小鼠，以产生单克隆抗体。此外，不同的小鼠用相当于MDC成熟态N端(SEQIDNO21-12位残基)的化学合成肽段免疫。肽在应用生物系统型号473A肽合成仪(福斯特城，CA)合成，按厂家介绍的方法，连接到钥孔_血蓝素(Pierce)上。开始注射时，约10μgMDC蛋白或连接肽用弗氏完全佐剂乳化，皮下注射。间隔2-3周后，附加量的MDC蛋白用弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射。在最后灌注增强(prefusionboost)前，从免疫小鼠中取出血清样品。这些血清用western印迹法分析，以证实其和MDC蛋白的反应性。为灌注增强，小鼠用在PBS中的MDC液注射，四天后杀死小鼠取出脾脏。脾放在10ml无血清的RPMI1640中，在二片玻璃显微镜载片磨砂端研磨浸在添加2mML-谷氨酸、1mM丙酮酸钠，100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco，加拿大)的无血清RPMI1640中的脾，形成单细胞悬液。细胞悬液用无菌的70目Nitex细胞滤过器(strainer)(BectonDickinson，Parsippany，NewJersey)过滤，离心200g5分钟洗二次，重悬沉淀在10ml无血清RPMI中。取自三次未做过实验的Balb/c小鼠的胸腺细胞，以相似的方法制备用作滋养层。NS-1骨髓瘤细胞，融合前在含10％胎牛血清(FBS)(Hyclone实验室，Inc，Logan，Utah)的RPMI中维持其对数期三天，200g，5分钟离心收集，按前段所述的方法洗沉淀二次。将脾细胞(2×108)和4×107NS-1细胞混合，离心，吸去上清。轻敲离心管移动细胞沉淀，加2ml37℃的PEG1500(50％在75mMN-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸中(Hepes))(BoehringerMannheim)，搅拌1分钟以上，接着加14ml无血清RPMI，7分钟以上。加另外的16mlRPMI，细胞用200g离心10分钟。去上清液后，沉淀重悬在含15％FBS、100μM次黄嘌呤钠，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸腺嘧啶核苷(HAT)(Gibco)，25untis/ml白细胞介素-6(BoehringerMannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml的200mlRPMI中，植板于10个Corning平底96孔培养板(Corning，Corning纽约)中。融合后第2，4和6天，从融合板的孔中移去100μl培养基，重加100μl新鲜培养基。在第8天，按下列检测存在能结合MDC的鼠IgG的ELISA法筛选融合细胞。Immulon4板(Dynatech，Cambridge，MA)用稀释在25mM三羟甲基氨基甲烷，pH7.5中每孔100ng的MDC，37℃包被2小时。吸去包被液，每孔加200μl封闭液[稀释在CMF-PBS中0.5％鱼皮明胶(西格玛)]，37℃温育30分钟。吸去封闭液，加50μl培养上清。37℃温育30分钟后，用含0.05％吐温20(PBST)的PBS洗三次，加50μl以1∶7000稀释在PBST中偶联的羊抗小鼠IgG(fc)辣根过氧化酶(杰克逊免疫研究，西格罗夫，宾夕法尼亚)。将板按上法温育，用PBST洗4次，加100μl在100mM柠檬酸盐，pH4.5中含1mg/ml邻苯二胺(西格玛)和0.1μl/ml30％过氧化氢组成的底物液。5分钟后，加50μl15％的硫酸终止颜色反应。在板读数仪(Dynafech)上读A490值。选出的融合细胞稀释在96孔板中克隆二次，5天后可数每孔的克隆数。由杂交瘤产生的单克隆抗体用Isostrip系统(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)同型化。抗MDC的抗体，用western印迹法抗上述在大肠杆菌或哺乳CHO细胞产生的重组MDC，进一步确定其特点。为准备印迹，约3μl沉淀细胞(产生MDC的转化大肠杆菌，产生MDC的转染CHO细胞；未转化的大肠杆菌(对照)；和未转染CHO细胞(对照))溶解在含SDS(十二烷基硫酸钠)和DTT(二硫苏糖醇)的标准样品制备缓冲液中(圣姆布鲁克等)。煮沸后，裂解液通过变性SDS-PAGE(18％丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷甘氨酸凝胶，NOVEX)分级分离，电印迹到PVDF膜上(Millipore，Bedford，MA)。MDC单克隆抗体用PBS稀释到0.7μg/ml，按照标准技术(圣姆布鲁克等)，用于蛋白印迹。作为另外的对照，进一步测试单克隆抗体对人皮肤、扁桃体和胸腺的全组织裂解液的蛋白印迹带的交叉反应性。有一抗MDC的单克隆抗体，命名为单克隆抗体191D，它与细菌和哺乳动物细胞产生的重组MDC有强烈反应。而且，该抗体显示对所试的细菌、CHO哺乳动物细胞系或全部人组织非常小背景反应性。此外，该抗体表现为按照标准的免疫沉淀方法(圣姆布鲁克等)，能免疫沉淀来自CHO的重组MDC。产生单克隆抗体191D(命名为杂交瘤191D)的杂交瘤细胞系，按照布达佩斯特条约的条款(ATCC保藏日期1996年6月4日；ATCC登记号HB-12122)，存放在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，12301ParklawnDriVe，RockVilleMD20852(美国)。保藏材料的存活性不应仅理解为当在违反任何政府当局根据其专利法授予的权利时的通行证。B.多克隆抗体抗MDC的多克隆抗体，按照标准方案(圣姆布姆克等)，在兔中产生。上述以GST融合蛋白产生的重组MDC用PBS稀释，弗氏完全佐剂乳化，皮下注射到兔中。间隔3-6周，另外稀释在PBS中的MDC用弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射到相同的兔子中。第三次免疫后10天，从兔中抽取血清，用10倍的含0.5％吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液稀释(TBS-T，圣姆布姆克等)，通过上述抗重组MDC的蛋白印迹法定性。实施例19钙流测定细胞内钙浓度的变化，为趋化因子细胞活化的指标，用公认技术的钙流测定法在几个细胞系中进行了监测，细胞在室温下温育在1ml含1μMFura-2/AM(分子探针，Eugene，OR)的完全培养基中30分钟，洗一次，以～106细胞/ml重悬在D-PBS中。2ml悬浮细胞放在位于荧光计(AMINCO-BowmanSeries2，罗彻斯特，NY)内37℃下不断搅拌的小杯中。胞内钙浓度用荧光表示，这是以0.5秒间隔转换340nm和380nm的激发波长时，在发射波长510nm处所测定的荧光值。从340nm到380nm激发波长的发射比率相当于胞内钙水平。该测定测量的细胞系包括如下稳定转染公认的趋化因子受体基因V28[莱普特等，基因，163295-299(1995)]的人胚肾HEK-293细胞系；稳定转染趋化因子受体基因CCR5的HEK-293细胞[塞姆森等，生物化学，353362-3367(1995)；也见共同拥有，共同未决的美国专利申请，流水号08/575,967，提交日期1995年12月20日，在此引入参考，公开趋化因子材料和方法，包括CCR5(在那认作“88C”)]，人单核THP-1细胞系，人肺上皮A-549细胞系；人成纤维IMR-90细胞系。这些细胞对重组MDC蛋白应答时均没有钙流。作为阳性对照，HEK-293转染细胞对凝血酶有强烈反应，提示测定是有效的。此外，THP-1细胞对终浓度为25ng/ml购买的趋化因子MCP-1和MCP-3(Peprotech，RockyHill，NJ)有强烈反应。对A-549或IMR-90细胞系，未测定另外的刺激。实施例20HIV增殖的抑制作用几种CC趋化因子涉及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的增殖，HIV是人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的诱发因素。见科克希等，科学，2701811(1995)。MDC抗HIV增殖的活性用科克希等所述的方法测量，在该方法中，CD4+T细胞用HTV株急性感染，在不同浓度的MDC存在下培养。三天后，往细胞中加含新鲜稀释MDC的培养基。感染后5～7天，HIV水平用商业化的ELISA检测盒(科尔特，迈阿密，FL)，检测培养上清存在的HIVp24抗原测量。检测了抗MDC的抗体中和由人淋巴细胞产生的抑制活性的能力(科克希，同上)此外，在HIV抑制测定中，化学合成的MDC类似物(实施例11)或重组方法产生的类似物的功效也进行了测试。实施例21MDC对成纤维细胞增殖的影响除了能吸引和活化白细胞外，一些趋化因子如IL-8，表明能影响非白细胞性的细胞增殖[见达斯悉尔，J.Invest.Dermatol.，92294-298(1992)]。整个机体的成纤维细胞对大多数组织的完整性是重要的。成纤维细胞增殖对伤口愈合和对损伤的反应是必不可少的，但在慢性炎性疾病如肺纤维化的情况下，也是有害的[番恩，炎症免疫学，Elsevier(1983)，pp.121-162)]。体外细胞增殖测定用于估计MDC对成纤维细胞增殖的影响。人成纤维细胞(CRL-1635)从ATCC获得，在含10％FBS和1％抗生素的DMEM中维持培养。增殖测定的操作和定量，按本领域由戴赫尔姆和番恩，美国病理学杂志，134355-363(1989)前述的方法。简言之，第一天，在含10％FBS的DMEM中，2.5×103细胞/孔种到96孔板上。第二天植板24小时后，细胞上的培养基换成无血清的DMEM。第3天培养基从细胞中移去，代之以含0.4％FBS稀释有MDC的DMEM。第5天每孔加1微居里的3H胸腺嘧啶核苷，继续温育5小时。把细胞收获到玻璃纤维滤膜上。细胞增殖率以掺入到成纤维细胞中的3H胸腺嘧啶核苷的cpm表示。该测定的对照包括测定所用的基本培养基，含0.4％FBS的DMEM作阴性对照，含10％FBS的DMEM作阳性对照。如图7所示，MDC处理以剂量依赖方式降低成纤维细胞的增殖。用从CHO细胞纯化的MDC(实心圆圈)和化学合成的MDC(空心圆圈)观察到相似的成纤维细胞增殖抑制作用。MDC抗成纤维细胞增殖的效应显示有治疗用途，用MDC处理如肺纤维化和肿瘤疾病，这些疾病中，增强或失控的细胞增殖是主要特征。实施例22细胞增殖测定测定MDC对上皮细胞、T细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞增殖的影响，用本领域熟知的如戴赫尔姆等，美国病理学杂志，134355-363(1989)所述的方法和“免疫学现代方法”书中3-4节，“淋巴细胞功能体外测定”由威利和桑斯(1992)所写的生长因子活性测定法。在这些方法中，测量了细胞生长的增强和抑制作用和生长因子的释放。MDC对上皮细胞和内皮细胞增殖影响的测定，用上述对成纤维细胞(实施例21)相同的步骤。用外周血淋巴细胞，测定对T细胞增殖的影响。单核细胞按戴赫尔姆等，美国病理学杂志，135571-580(1989)所述的方法，从外周血中分离；细胞重悬在含10％FBS的RPMI中，在塑料培养瓶中温育过夜。淋巴细胞仍悬浮在这些培养物中，离心培养液得到。10万个淋巴细胞接种到96孔板的一孔中，在含1μg/ml植物血球凝集素(PHA)加或不加50、125、250或500ng/mlMDC的培养基(RPMI加10％FBS)中培养3天。在培养最后18小时，加1微居里的3H-胸腺嘧啶核苷。收获细胞，增殖率按实施例21所述的用于成纤维细胞的方法表示。测定MDC对巨噬细胞增殖的影响，用按上述实施例13中获得的激活的豚鼠腹腔巨噬细胞。巨噬细胞以每孔10万个细胞的密度在含10％FBS的RPMI中，植到96孔板中，温育2小时使细胞贴壁。然后移去培养基，代以加或不加50、125、250或500ng/ml的MDC的新鲜培养基。细胞和MDC温育3天，按上述用于淋巴细胞的方法测定增殖率。趋化因子介导的这些类型细胞的增殖控制，在损伤后加强组织修复和在慢性炎症反应如牛皮癣、纤维化、动脉粥样硬化和肿瘤疾病中限制这些细胞增殖时，有治疗意义。实施例23成纤维细胞增殖的体内测定体内测定MDC对成纤维细胞抗增殖的影响，用本领域公认的方法，如番恩和方托恩，美国病理学杂志，50587-591(1984)的报道方法，该法用博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型。该模型特征明确，允许在疾病的整个阶段估计成纤维细胞的增殖和胶原合成。简言之，把大鼠分为4个处理组1)对照，给予生理盐水气管内注射；2)盐水注射大鼠，再接受每天腹腔注射盐水中的500ngMDC；3)博莱霉素处理，给予1.5mg/kg博莱霉素(Calbiochem，PaloAlto，CA)气管内注射；4)博莱霉素处理大鼠再给予每天腹腔注射500ngMDC。开始气管注射后4、7、14、21和28天，每组杀三只大鼠。取肺，每个肺叶样品作组织学检查和胶原含量测定。实施例24MDC调节因子测定MDC活性的调节因子(modulator)，对MDC在其中起作用的疾病或疾病症状的处理可能是有用的。以上调节因子要么是MDC结合的激动剂或是拮抗剂。以下的受体结合测定提供方法识别以上的MDC调节因子。MDC用可检测的标记物如125I、3H、14C、生物素或铕标记。含MDC受体的细胞膜制备自对MDC有应答的自然细胞，如人巨噬细胞、佛波酯激活的THP-1细胞、人成纤维细胞、人成纤维细胞系或豚鼠巨噬细胞。(替代的方法是当以上MDC受体cDNA被鉴定和克隆时，从转染MDC受体cDNA的细胞中制重组受体制备物)。例如，膜制品暴露在125I标记的MDC中，在合适的条件下温育(如37℃10分钟)。然后在滤膜上真空过滤收集任何方式结合125I-MDC的膜，清洗移去未结合的125I-MDC。然后把膜放到液体闪烁分光光度计中定量和结合MDC有关的放射性。MDC结合的特异性可在增加未标记MDC的数量的情况下，重复前面的方法，测定竞争性地结合到受体的水平证实。这些结合测定也能用于识别MDC受体结合的调节因子。前面的受体结合测定也可作如下修改进行除标记MDC外，待定的MDC调节因子放到膜制品中。在这改变的测定方法中，膜有关的标记物增加水平(数量)显示待定的调节因子是MDC结合的活化因子；膜有关的标记物降低水平(数量)显示待定的调节因子是MDC受体结合的抑制剂。该测定方法能用于从大量的化合物或天然产物中识别MDC结合的特异活化剂和抑制剂。同时快速地筛选大量调节因子候选化合物是特别希望的。如上述阐明的MDC的生物学功能，表明有几方面的临床用途。一般来说，趋化因子吸引和活化单核细胞和巨噬细胞(巴格欧里尼等，同上)，MDC特别地吸引巨噬细胞和抑制单核细胞趋化性。这样在病原性炎性固定点的MDC表达，可通过补充另外的巨噬细胞或白细胞到疾病位点，活化已经存在的白细胞，或诱导白细胞仍在疾病位点而加重病态。因而，抑制MDC的化学引诱活性可望减轻有害的炎性过程。有意义的是上述方法的潜在好处已在涉及IL-8的实验中被直接阐明，IL-8是吸引和活化中性粒细胞的C-X-C细胞趋化因子。直接抗IL-8的抗体具有极强的能力。抑制由中性粒细胞介导的炎性疾病[哈拉达等，Leukoc.Biol.56559(1994)]。可望MDC的抑制作用在假定巨噬细胞起作用的疾病如节段性回肠炎，风湿性关节炎或动脉粥样硬化中，具有相似的效果。可供选择的是，增加MDC的影响可能在以上疾病中具有有益的作用，因为已经表明趋化因子在伤口愈合和血管生成中有正作用。这样，外源的MDC或MDC激动剂可能在促进以上疾病恢复中是有益的。此外，阐明C-C趋化因子MIP-1α(梅兹等，同上)的骨髓抑制效应表明MDC可能有相似的活性。由MDC或MDC激动剂提供的以上活性，对接受化学疗法或放射疗法的病人产生实际的益处，降低治疗对病人髓样祖细胞的有害影响。也可证明MDC或MDC激动剂在治疗肿瘤时有临床的重要性，如已表明C-C趋化因子TCA3能抑制小鼠的肿瘤形成(见兰宁等，同上)。MDC可直接或间接地抑制肿瘤形成而起作用，如吸引和活化不同的非特异效应细胞到肿瘤位点或激活特异的抗肿瘤免疫。MDC抗成纤维细胞增殖的效应显示MDC在治疗诸如肺纤维化和肿瘤这些疾病的治疗用途，这些疾病中，增强或失控的细胞增殖是主要的特征。当本发明按特别的实施方案描述时，可以理解本领域的技术人员会想到变化的和修改的方法。因此，本发明只受所附权利要求中限制因素的限制。序列表(1)总的信息(i)申请人Godiska，Ronald；Gray，PatrickW.(ii)发明题目巨噬细胞来源的趋化因子和趋化因子类似物(iii)序列数32(iv)通信地址(A)收信人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray&Borun(B)街道6300SearsTower，233SouthWackerDrive(C)城市芝加哥(D)州伊利诺斯(E)国家美利坚合众国(F)邮区60606-6402(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(vi)当前申请数据(A)申请号(B)提交日期(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号08/558,658(B)提交日期1995年11月16日(vii)在先申请数据(A)申请号08/479,620(B)提交日期1995年6月7日(viii)委托人/代理人信息(A)姓名Gass，DavidA.(B)登记号38,153(C)参考/档案号27866/33318(ix)电讯信息(A)电话312/474-6300(B)传真312/474-0448(C)用户电报25-3856(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)长度2923碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置20..298(ix)特征(A)名称/键mat_肽(B)位置92..298(xi)序列描述SEQIDNO1GAGACATACAGGACAGAGCATGGCTCGCCTACAGACTGCACTCCTGGTTGTC52MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValVal-24-20-15CTCGTCCTCCTTGCTGTGGCGCTTCAAGCAACTGAGGCAGGCCCCTAC100LeuValLeuLeuAlaValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyr-10-51GGCGCCAACATGGAAGACAGCGTCTGCTGCCGTGATTACGTCCGTTAC148GlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyr51015CGTCTGCCCCTGCGCGTGGTGAAACACTTCTACTGGACCTCAGACTCC196ArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrpThrSerAspSer20253035TGCCCGAGGCCTGGCGTGGTGTTGCTAACCTTCAGGGATAAGGAGATC244CysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAspLysGluIle404550TGTGCCGATCCCAGAGTGCCCTGGGTGAAGATGATTCTCAATAAGCTG292CysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIleLeuAsnLysLeu556065AGCCAATGAAGAGCCTACTCTGATGACCGTGGCCTTGGCTCCTCCAGGAAGGCTCA348SerGlnGGAGCCCTACCTCCCTGCCATTATAGCTGCTCCCCGCCAGAAGCCTGTGCCAACTCTCTG408CATTCCCTGATCTCCATCCCTGTGGCTGTCACCCTTGGTCACCTCCGTGCTGTCACTGCC468ATCTCCCCCCTGACCCCTCTAACCCATCCTCTGCCTCCCTCCCTGCAGTCAGAGGGTCCT528GTTCCCATCAGCGATTCCCCTGCTTAAACCCTTCCATGACTCCCCACTGCCCTAAGCTGA588GGTCAGTCTCCCAAGCCTGGCATGTGGCCCTCTGGATCTGGGTTCCATCTCTGTCTCCAG648CCTGCCCACTTCCCTTCATGAATGTTGGGTTCTAGCTCCCTGTTCTCCAAACCCATACTA708CACATCCCACTTCTGGGTCTTTGCCTGGGATGTTGCTGACACTCAGAAAGTCCCACCACC768TGCACATGTGTAGCCCCACCAGCCCTCCAAGGCATTGCTCGCCCAAGCAGCTGGTAATTC828CATTTCATGTATTAGATGTCCCCTGGCCCTCTGTCCCCTCTTAATAACCCTAGTCACAGT888CTCCGCAGATTCTTGGGATTTGGGGGTTTTCTCCCCCACCTCTCCACTAGTTGGACCAAG948GTTTCTAGCTAAGTTACTCTAGTCTCCAAGCCTCTAGCATAGAGCACTGCAGACAGGCCC1008TGGCTCAGAATCAGAGCCCAGAAAGTGGCTGCAGACAAAATCAATAAAACTAATGTCCCT1068CCCCTCTCCCTGCCAAAAGGCAGTTACATATCAATACAGAGACTCAAGGTCACTAGAAAT1128GGGCCAGCTGGGTCAATGTGAAGCCCCAAATTTGCCCAGATTCACCTTTCTTCCCCCACT1188CCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTTTCGCTCTTGTCACCCACGCTGGAGTG1248CAATGGTGTGGTCTTGGCTTATTGAAGCCTCTGCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCTTGC1308CTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATTACAGGTTCCTGCTACCACGCCCAGCTAATTTTTGT1368ATTTTTAGTAGAGACGAGGCTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGTCCTC1428AGGTAATCCGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACAGTGC1488CTGGCCTCTTCCCTCTCCCCACTGCCCCCCCCAACTTTTTTTTTTTTTTTATGGCAGGGT1548CTCACTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTCGGCTCACTACAACCTCGAC1608CTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCCACCCCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGTGTG1668TGCCACTACGGCTGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGTTTCACCATATTGGCC1728AGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCTTCCTTGTGCTCCCAAAGTGCTG1788AGATTACAGGCGTGAGCTATCACACCCAGCCTCCCCCTTTTTTTCCTAATAGGAGACTCC1848TGTACCTTTCTTCGTTTTACCTATGTGTCGTGTCTGCTTACATTTCCTTCTCCCCTCAGG1908CTTTTTTTGGGTGGTCCTCCAACCTCCAATACCCAGGCCTGGCCTCTTCAGAGTACCCCC1968CATTCCACTTTCCCTGCCTCCTTCCTTAAATAGCTGACAATCAAATTCATGCTATGGTGT2028GAAAGACTACCTTTGACTTGGTATTATAAGCTGGAGTTATATATGTATTTGAAAACAGAG2088TAAATACTTAAGAGGCCAAATAGATGAATGGAAGAATTTTAGGAACTGTGAGAGGGGGAC2148AAGGTGAAGCTTTCCTGGCCCTGGGAGGAAGCTGGCTGTGGTAGCGTAGCGCTCTCTCTC2208TCTGTCTGTGGCAGGAGCCAAAGAGTAGGGTGTAATTGAGTGAAGGAATCCTGGGTAGAG2268ACCATTCTCAGGTGGTTGGGCCAGGCTAAAGACTGGGAGTTGGGTCTATCTATGCCTTTC2328TGGCTGATTTTTGTAGAGACGGGGTTTTGCGATGTTACCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTG2388GGCTCAAGCGATCCTCCTGGCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAATCAC2448TGCGCCTGGCTTCCTCTTCCTCTTGAGAAATATTCTTTTCATACAGCAAGTATGGGACAG2508CAGTGTCCCAGGTAAAGGACATAAATGTTACAAGTGTCTGGTCCTTTCTGAGGGAGGCTG2568GTGCCGCTCTGCAGGGTATTTGAACCTGTGGAATTGGAGGAGGCCATTTCACTCCCTGAA2628CCCAGCCTGACAAATCACAGTGAGAATGTTCACCTTATAGGCTTGCTGTGGGGCTCAGGT2688TGAAAGTGTGGGGAGTGACACTGCCTAGGCATCCAGCTCAGTGTCATCCAGGGCCTGTGT2748CCCTCCCGAACCCAGGGTCAACCTGCCTGCCACAGGCACTAGAAGGACGAATCTGCCTAC2808TGCCCATGAACGGGGCCCTCAAGCGTCCTGGGATCTCCTTCTCCCTCCTGTCCTGTCCTT2868GCCCCTCAGGACTGCTGGAAAATAAATCCTTTAAAATAGTAAAAAAAAAAAAAAA2923(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度93氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQIDNO2MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-24-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuArg101520ValValLysHisPheTyrTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysGluIleCysAlaAspProArg455055ValProTrpValLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO3GACACTATAGAATAGGGC18(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO4GTAAAACGACGGCCAGT17(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO5AATTAACCCTCACTAAAGGG20(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO6GTAATACGACTCACTATAGGGC22(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO7TCTATCTAGAGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAAG35(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO8CACCGGATCCTCATTGGCTCAGCTTATTGAGAA33(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO9AATGGATCCACAGCACGGAGGTGACCAAG29(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO10AGTCAAGCTTAGGGCACTCTGGGATCGGCAC31(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO11TATCGGATCCTGGTTCCGCGTGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA45(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)长度22碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO12GAAATCCAGCAAGTATATAGCA22(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO13ATTGCCATGGCCGGCCCCTACGGCGCCAACATGGAA36(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO14GACCAAGCTTGAGACATACAGGACAGAGCA30(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO15TGGATCTAGAAGTTGGCACAGGCTTCTGG29(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO16CGAAATTAATACGACTCACT20(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)长度67碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO17TGGATCTAGATCAATTCAAGTCCTCCTCGCTGATCAGCTTCTGCTCTTGGCTCAGCTTAT60TGAGAAT67(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)长度99氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息“HuMCP-3”(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..76(xi)序列描述SEQIDNO18MetLysAlaSerAlaAlaLeuLeuCysLeuLeuLeuThrAlaAlaAla-20-15-10PheSerProGlnGlyLeuAlaGlnProValGlyIleAsnThrSerThr-515ThrCysCysTyrArgPheIleAsnLysLysIleProLysGlnArgLeu10152025GluSerTyrArgArgThrThrSerSerHisCysProArgGluAlaVal303540IlePheLysThrLysLeuAspLysGluIleCysAlaAspProThrGln455055LysTrpValGlnAspPheMetLysHisLeuAspLysLysThrGlnThr606570ProLysLeu75(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)长度99氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键字misc_特征(D)其它信息“HuMCP-1”(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..76(xi)序列描述SEQIDNO19MetLysValSerAlaAlaLeuLeuCysLeuLeuLeuIleAlaAlaThr-20-15-10PheIleProGlnGlyLeuAlaGlnProAspAlaIleAsnAlaProVal-515ThrCysCysTyrAsnPheThrAsnArgLysIleSerValGlnArgLeu10152025AlaSerTyrArgArgIleThrSerSerLysCysProLysGluAlaVal303540IlePheLysThrIleValAlaLysGluIleCysAlaAspProLysGln455055LysTrpValGlnAspSerMetAspHisLeuAspLysGlnThrGlnThr606570ProLysThr75(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)长度76氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息“HuMCP-2”(xi)序列描述SEQIDNO20GlnProAspSerValSerIleProIleThrCysCysPheAsnValIle151015AsnArgLysIleProIleGlnArgLeuGluSerTyrThrArgIleThr202530AsnIleGlnCysProLysGluAlaValIlePheLysThrLysArgGly354045LysGluValCysAlaAspProLysGluArgTrpValArgAspSerMet505560LysHisLeuAspGlnIlePheGlnAsnLeuLysPro657075(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)长度91氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息“RANTES”(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..68(xi)序列描述SEQIDNO21MetLysValSerAlaAlaAlaLeuAlaValIleLeuIleAlaThrAla-20-15-10LeuCysAlaProAlaSerAlaSerProTyrSerSerAspThrThrPro-515CysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLys10152025GluTyrPheTyrThrSerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPhe303540ValThrArgLysAsnArgGlnValCysAlaAsnProGluLysLysTrp455055ValArgGluTyrIleAsnSerLeuGluMetSer6065(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)长度91氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息“MIP-1β”(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..68(xi)序列描述SEQIDNO22MetLysLeuCysValThrValLeuSerLeuLeuMetLeuValAlaAla-20-15-10PheCysSerProAlaLeuSerAlaProMetGlySerAspProProThr-515AlaCysCysPheSerTyrThrArgGluAlaSerSerAsnPheValVal10152025AspTyrTyrGluThrSerSerLeuCysSerGlnProAlaValValPhe303540GlnThrLysArgSerLysGlnValCysAlaAspProSerGluSerTrp455055ValGlnGluTyrValTyrAspLeuGluLeuAsn6065(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)长度92氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息“MIP-1α”(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..70(xi)序列描述SEQIDNO23MetGlnValSerThrAlaAlaLeuAlaValLeuLeuCysThrMetAla-20-15-10LeuCysAsnGlnPheSerAlaSerLeuAlaAlaAspThrProThrAla-51510CysCysPheSerTyrThrSerArgGlnIleProGlnAsnPheIleAla152025AspTyrPheGluThrSerSerGlnCysSerLysProGlyValIlePhe303540LeuThrLysArgSerArgGlnValCysAlaAspProSerGluGluTrp455055ValGlnLysTyrValSerAspLeuGluLeuSerAla606570(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)长度96氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息“I-309”(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..73(xi)序列描述SEQIDNO24MetGlnIleIleThrThrAlaLeuValCysLeuLeuLeuAlaGlyMet-20-15-10TrpProGluAspValAspSerLysSerMetGlnValProPheSerArg-515CysCysPheSerPheAlaGluGlnGluIleProLeuArgAlaIleLeu10152025CysTyrArgAsnThrSerSerIleCysSerAsnGluGlyLeuIlePhe303540LysLeuLysArgGlyLysGluAlaCysAlaLeuAspThrValGlyTrp455055ValGlnArgHisArgLysMetLeuArgHisCysProSerLysArgLys606570(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)长度93氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/键蛋白质(B)位置1..69(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息提示/＝“24位的氨基酸选自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸”(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息提示/＝“27位的氨基酸分别选自赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和甲硫氨酸”(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息/提示＝“30位的氨基酸分别选自酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸”(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息/提示＝“50位的氨基酸分别选自谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸和丙氨酸”(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息/提示＝“59位氨基酸选自色氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸”(ix)特征(A)名称/键misc_特征(D)其它信息/提示＝“60位氨基酸选自丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸”(xi)序列描述SEQIDNO25MetAlaArgLeuGlnThrAlaLeuLeuValValLeuValLeuLeuAla-20-15-10ValAlaLeuGlnAlaThrGluAlaGlyProTyrGlyAlaAsnMetGlu-515AspSerValCysCysArgAspTyrValArgTyrArgLeuProLeuXaa101520ValValXaaHisPheXaaTrpThrSerAspSerCysProArgProGly25303540ValValLeuLeuThrPheArgAspLysXaaIleCysAlaAspProArg455055ValProXaaXaaLysMetIleLeuAsnLysLeuSerGln6065(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO26TATTGGATCCGTTCTAGCTCCCTGTTCTCC30(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO27CCAAGAATTCCTGCAGCCACTTTCTGGGCTC31(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO28GCGACTCTCTACTGTTTCTC20(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO29CACAGGAAACAGCTATGACC20(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)长度70氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO30LeuGlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAsp151015TyrValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrp202530ThrSerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArg354045AspLysGluIleCysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIle505560LeuAsnLysLeuSerGln6570(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)长度69氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO31GlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyr151015ValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysHisPheTyrTrpThr202530SerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAsp354045LysGluIleCysAlaAspProArgValProTyrLeuLysMetIleLeu505560AsnLysLeuSerGln65(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特征(A)长度69氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO32GlyProTyrGlyAlaAsnMetGluAspSerValCysCysArgAspTyr151015ValArgTyrArgLeuProLeuArgValValLysGluTyrPheTyrThr202530SerAspSerCysProArgProGlyValValLeuLeuThrPheArgAsp354045LysGluIleCysAlaAspProArgValProTrpValLysMetIleLeu505560AsnLysLeuSerGln65</tables>关于微生物保藏的说明(细则13之二)PCT/RO/134表(1992年7月)权利要求1.编码具有SEQIDNO2的巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)氨基酸序列的多肽的纯化多核苷酸。2.权利要求1的为DNA的多核苷酸。3.权利要求2的具有SEQIDNO1的20-298位核苷酸的DNA。4.编码MDCSEQIDNO2的1-69位氨基酸的纯化多核苷酸。5.权利要求4的为DNA的多核苷酸。6.权利要求5的具有SEQIDNO1的92-298位核苷酸的DNA。7.选自如下的纯化的多核苷酸(a)SEQIDNO1的DNA；(b)在严谨条件下能与SEQIDNO1的DNA非编码链杂交的多核苷酸；(c)由于遗传密码的冗余性，在严格条件下能与SEQIDNO1的DNA非编码链杂交的多核苷酸；和(d)与SEQIDNO1的DNA编码相同的多肽的多核苷酸。8.权利要求7的为DNA的多核苷酸。9.编码具有SEQIDNO25氨基酸序列的多肽的纯化多核苷酸。10.权利要求9的为DNA的多核苷酸。11.编码SEQIDNO25的1-69位氨基酸的纯化的多核苷酸。12.权利要求11的为DNA的多核苷酸。13.选自如下的纯化的多核苷酸(a)权利要求12的DNA；(b)在严格条件下能与权利要求12杂交的多核苷酸；和(c)由于遗传密码的冗余性，在严格的条件下能与权利要求12的DNA杂交的多核苷酸。14.权利要求13的为DNA的多核苷酸。15.包含权利要求2、5、8、10、12或14的DNA的载体。16.权利要求15的为表达载体的载体，其中DNA能可操作地与表达控制DNA序列连接。17.以一种可在所述宿主细胞中表达MDC的方式用权利要求2或5的DNA稳定转化或转染的宿主细胞。18.产生MDC的方法，所述的方法包括在营养培养基中培养权利要求17的宿主细胞和从所述的细胞或培养基中分离MDC。19.以一种可在所述宿主细胞中表达MDC多肽类似物的方式由权利要求10或12的DNA稳定转化或转染的宿主细胞。20.产生MDC多肽类似物的方法，所述的方法包括在营养培养基中培养权利要求19的宿主细胞和从所述的细胞或培养基分离MDC多肽类似物。21.具有SEQIDNO25的氨基酸序列的纯化多肽。22.权利要求21的具有SEQIDNO2的氨基酸序列的纯化多肽。23.具有SEQIDNO25的1-69位氨基酸的纯化多肽。24.根据权利要求23具有SEQIDNO2的1-69位氨基酸的纯化多肽。25.选自如下的多肽(a)包含鉴定为SEQIDNO30的1-70位的氨基酸序列的多肽；和(b)包含鉴定为SEQIDNO2的9-69位的氨基酸序列的纯化多肽；和(c)包含鉴定为SEQIDNO31的1-69位识别的氨基酸序列的多肽；和(d)包含鉴定为SEQIDNO32的1-69位识别的氨基酸序列的多肽。26.编码权利要求25的多肽的多核苷酸。27.权利要求26的是DNA的多核苷酸。28.包含权利要求27的DNA的载体。29.用权利要求27的DNA以一种可在所述宿主细胞中表达所述多肽的方式稳定转化或转染的宿主细胞。30.一种与权利要求21，22，23，24或25的多肽特异反应的抗体。31.根据权利要求30为单克隆抗体的抗体。32.产生权利要求31的抗体的杂交瘤细胞系。33.包含按权利要求30抗体的多克隆抗血清。34.和MDC起特异反应的抗体。35.在哺乳动物宿主中调节白细胞趋化性的方法，它包括如下步骤(a)给所述的哺乳动物宿主施用权利要求21、22、23、24或25的多肽，其中所述的多肽在所述的宿主中能调节白细胞趋化性。36.权利要求35的方法，其中所述的白细胞选自单核细胞和巨噬细胞。37.减轻病人炎症疾病的方法，所述的疾病其特征至少是(i)在所述的病人中单核细胞向炎症位点趋化或(ii)成纤维细胞增殖中之一，所述的方法包括如下步骤(a)给病人施用治疗有效量的MDC。38.权利要求37的方法，其中所述的治疗有效量的MDC是能抑制单核细胞趋化性的量。39.按权利要求37的方法，其中所述的治疗有效量的MDC是能抑制成纤维细胞增殖的量。40.包含SEQIDNO1核苷酸序列的一个连续部分或与其互补的非编码链的DNA，所述的连续部分包含至少18个核苷酸，所述的DNA在严谨条件下能和人MDC基因杂交。41.权利要求40的DNA，其中所述的DNA在所述的严谨条件下，不能与选自MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、RANTES基因、MIP-1α基因、MIP-1β基因和I-309基因的人趋化因子基因杂交。42.在药学上可接受的载体中包含权利要求21，22，23，24或25的多肽的药用组合物。43.权利要求42的组合物在治疗炎性疾病状态中的用途。44.权利要求43的用途，其中所述的炎性疾病状态其特征在于在具有所述疾病状态的病人中，单核细胞向炎症位点趋化。45.按权利要求43的用途，其中所述的炎性疾病状态其特征在于具有所述疾病状态的病人中，成纤维细胞增殖。46.鉴定具有MDC调节活性的化合物的方法，包括步骤(a)提供包含MDC受体的第一和第二受体组合物；(b)提供包含可检测标记的MDC的对照组合物；(c)提供包含可能检测标记的MDC和进一步包含所述化合物的测试组合物；(d)在MDC能与MDC受体结合的情况下，用对照组合物接触第一受体组合物；(e)在MDC能与MDC受体结合的情况下，用检测组合物接触第二受体组合物；(f)洗去第一和第二受体组合物，以移去未与MDC受体结合的可检测标记的MDC；(g)在所述的第一和第二受体组合物中测定可检测标记的MDC；和(h)鉴定含MDC调节活性的化合物，其中MDC调节活性与被可检测标记的MDC在所述的第一和第二受体组合物中的差异有关。全文摘要本发明提供了编码一种新的称为MDC的人巨噬细胞来源的趋化因子及其多肽类似物的纯化和分离的多核苷酸序列。还提供了重组生产该趋化因子，和纯化和分离的趋化因子蛋白，以及多肽类似物的材料和方法。文档编号C12N15/19GK1163635SQ96190875公开日1997年10月29日申请日期1996年6月7日优先权日1996年6月7日发明者R·戈迪斯卡,P·W·格雷申请人:艾科斯有限公司