专利名称：：Dna片断和含有该dna片断的重组载体以及应用其之后外源基因的表达方法
技术领域：
：本发明是关于对基因的表达起促进作用的新DNA片断和含有DNA片断的重组载体，以及应用其后外源基因的表达方法的。
背景技术：
：促进外源基因表达的技术是将基因工程技术应用于植物时最必要的技术之一。其方法之一就是利用具有能促进基因表达的碱基序列的DNA。促进外源基因表达的碱基序列，众所周知有蓖麻的过氧化氢酶的内含子等[特开平03-103182；Tanakaetal.NucleicAcidsRes.18，6767-6770(1990)]。可是，所要的的植物种类繁多，也有必要促进生育阶段或组织器官中的外源基因的表达；因此，期待着开发可利用的能促进多种基因表达的DNA。
发明内容因此，本发明的目的就提供一种可促进外源基因表达的新DNA，它与已知的能促进外源基因表达的DNA序列不同。经本专利的发明者们的精心研究，完成了本发明，其发明点是通过比较稻子的磷脂酶D(以下称为“PLD”)的cDNA和稻子的染色体组DNA的碱基序列，发现了PLD的基因的内含子，而且发现了其中一个内含子对其下游基因的表达有明显促进作用。也就是说，本发现提供了具有序列表中序列号1所示的碱基序列的分离的DNA片断以及在该碱基顺序中增加、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸，并对其下游基因的表达有促进作用的分离的DNA片断。本发明还提供了含有上述本发明中的DNA片断和与其下游功能性连接的待表达的外源基因的重组载体。本发明还提供了外源基因的表达方法，即将本发明中上述重组载体导入宿主细胞以使上述外源基因表达出来。通过下面的实验可以确认，本发明中的DNA片断大大促进了其下游基因的表达。因此，本发明在利用基因工程技术来使外源基因表达方面做出了很大贡献。附图简述图1示在本发明实施例中插入了本发明的DNA片断的pBI221的基因图的关键部位。发明的最佳实施方案如上所述，本发明的DNA片断具有序列表中序列号1的碱基序列。本发明的DNA片断象下述实施例中所讲的那样，通过比较稻子PLD基因的cDNA和与其相应的稻子的染色体组DNA的碱基序列来鉴定稻子PLD基因上游的(内含子区，用PCR制备含有173bp内含子序列的片断(该内含子位于上述内含子的5′端)与非编码区域相应的位置上)，并组装到载体中报告基因的上游。通过比较该报告基因的表达活性，确认了对下游基因表达起了促进作用的片断。本发明的DNA片断的碱基序列相当于序列表中序列号3所表示的稻子基因组PLD基因碱基序列的第1661～1843碱基。还将位于稻子PLD基因上游的上述173bp内含子区序列的碱基序列以序列表的序列号4表示。序列号4所表示的序列对下游基因的表达当然具有促进作用。序列号4所表示的碱基序列相当于序列表中序列号3所表示的稻子基因组PLD基因碱基序列的第1666～第1838碱基。本发明的DNA片断是位于稻子PLD基因上游的内含子区，通过本发明明确了其碱基序列；所以，可以采用把稻子的染色体组DNA为模板的PCR法，很容易制备出本发明的DNA片断。PCR法是基因工程领域中经常采用的方法，采用此方法要用的成套仪器市场上均可买到；因此，专业人员很容易实施此方法。在下述实施例中，详细叙述一具体实施例。一般在具有生理作用的DNA序列中，即使增加、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸，也可以维持其生理活性的观点，在专业人员当中正在得到广泛的承认。本发明也进行了这种修饰，而且包含对下游基因的表达有促进作用的DNA片断。也就是说，在序列表中序列号1所示的碱基序列中，增加、缺失或置换一个或数个核苷酸，而且对其下游基因的表达有促进作用的DNA片断也包括在本发明的范围内。特别是序列号1所示的碱基序列中5′末端的5碱基及3′末端的6碱基是外显子部分，所以缺失这些序列的DNA片断对基因的发现也有促进作用，这些片断也包括在本发明的范围之内。核苷酸的扩增、插入、缺失或置换可以采用众所周知的定点突变法(例如核酸研究，Vol.10，No.20，P6487-6500，1982)技术就可以做到；本说明书中讲的“一个或数个核苷酸”的意思就是采用定点突变法，可以增加、插入、缺失或置换的核苷酸的数量。除了所要求的变异不一致之外，可以按下述方法用互补合成的寡核苷酸引物对应接受变异的主链噬菌体DNA进行定点突变。即以上述合成的寡核苷酸为引物给噬菌体合成互补链，用所得到的双链DNA转化成含噬菌体的宿主细菌。将转化了的细菌培养物做成琼脂培养基，使其从含有噬菌体的单一细胞形成噬菌斑。这样，理论上讲50％的新集落含有单链变异的噬菌体，剩余的50％具有原来的序列。使所得到的噬菌斑与其具有上述所要求的变异的DNA完全相同的DNA形成混合物，在与具有原来链的不相同的DNA不形成混合物的温度下，使其与激子酶处理过的合成探针形成混合物。然后，挑选出与该探针形成混合物的噬菌斑，进行培养，回收DNA。另外，在碱基序列中，做为对下游基因的表达不丧失促进作用的置换、缺失、扩增或插入一个或数个核苷酸的方法，除了上述定点突变之外，还有用变异原处理基因的方法以及选择性地分裂基因，然后把选择出来的核苷酸除去、增加、插入或置换，并进行连接的方法。本发明中的DNA片断对其下游基因的表达有促进作用。因此，通过把本发明中的DNA片断插到的外源基因的转录部位的5′末端，就可以促进该外源基因的表达。外源基因的表达方法在基因工程领域中已被确立。这种方法是把所希望得到的外源基因插到表达载体的克隆部位，并将其导入宿主细胞，即可使外源基因表达。而且，本发明是按着这种常规方法来使外源基因表达的，方法是将上述本发明中的DNA片断，在与该外源基因功能性连接的状态下，插到该外源基因的上游，这样来使该外源基因表达。这里所谓的本发明的片断与其应找出的下游基因“功能性连接”的意思是指插入本发明的DNA片断，与不插入该DNA片断相比，上述外源基因的表达水平增加了，并可以检测出来。本发明中的DNA即可插到待促进表达的外源基因的紧上游，也可以在本发明中的DNA与该外源基因之间夹杂其它序列。此序列的长度没有特别限定，但通常为0～1000bp左右。本发明中的DNA片断的上游虽还有启动子序列，但本发明的DNA片断即可以插到启动子的紧下游，也可以在启动子和本发明的DNA之间夹杂其它序列。该序列的长度没有特别的限定，但通常为0～1000bp左右。关键是由于插入本发明的DNA片断与未插入该DNA片断相比，对于上述外来基因的表达水平增加了，并可以检测出来，其重组载体均包括在本发明的范围内。因知道已有载体的克隆部位的碱基序列，所以使用适当的限制酶和连接程序(根据需要)即可很容易将本发明的DNA片断插到载体中。众所周知，在该领域中有多种这种被发现的载体，而且在市场上有销售。这些被发现的载体至少要包含在宿主细胞内进行复制的复制起点、启动子、给出用于插入外源基因的限制性酶切位点的克隆部位以及抗药性基因等的选择标记，一般包含有稳定结束复制的终止子和SD序列(宿主为细菌时)。本发明方法采用这些众所周知的被发现的任何一种载体均可。实施例下面，用实施例对本发明的内容做进一步具体说明。当然，本发明不限于下述实施例。1.米糖PLD的纯化纯化时，请参考米糠PLD的纯化的有关文献[高野等人，日本食品工业学会志34，8-13(198)]。酶活性是以磷脂酰胆碱为底物，用胆碱氧化酶法定量测定酶反应生成的胆碱。[Imamuraeral.，J.Blochem.83，677-680(1978)]，但是，PLD的酶反应是在95℃的条件下进行5分钟的热处理后停止。也就是将1立升己烷加到100g“舆光”(コシヒカリ)稻(Oryza，SatiVa)的米糠中，搅拌一昼夜，脱脂后加入由10g波里古拉鲁AT(ボリヮラ-ル)(商品名聚乙烯吡咯烷酮、GAFChemical公司制)、500ml的1mMCaCl2、5mM2-巯基乙醇组成的10mMTris-HCl缓中液(pH7)，搅拌1小时，将酶提取出来。把提取液用8层纱布过滤，然后用15,000×g离心20分钟，将中层做为粗提取液。将粗提取液用硫铵处理(65％饱和)、用离心分离(15,000×g，20分钟)方法，收集生成的沉淀，将沉淀溶解后，透析到上述缓冲液中。透析后，离心，除去沉淀做为硫铵试样(画分)。将此硫铵试样用缓冲液A(10mMTris-HClpH7，1mMCaCl2，1mM2-巯基乙醇)注入老化过的DEAE-纤维素[瓦特曼(ヮシトマン)公司制]的色谱柱(2.0×10cm)中。用约100ml含有50mMNaCl的缓冲液A清洗，然后用120mlNaCl线性浓度梯度为50～350mM的缓冲液A洗脱。PLD用浓度约为0.2M的NaCl进行洗脱。回收代表PLD活性的级分，做为洗脱液(DEAE-纤维素)。在洗脱液(DEAE-纤维素)中加入3M的硫铵，配成1M的硫铵溶液，用含有1M的硫铵的缓冲液A注入老化过的Phenylsepharose色谱柱[法马西亚(フマルマシァ)公司制，2.6×10cm]中。用240ml硫铵浓度梯度为1.0～0M的缓冲液A抽提。PLD用浓度约为0.1M的硫铵抽提。回收代表活性的级分，透析到缓冲液A中，做为洗脱液(Phenylsepharose)。将洗脱液(Phenylsepharose)用缓冲液A注入老化过的Phenylsepharose色谱柱(法马西亚(フマルマシァ)公司制，2.6×10cm)中。用240ml硫铵浓度梯度为1.0～0M的缓冲液A抽提。PLD用浓度约为0.1的硫铵抽提。回收代表活性的级分，透析到缓冲液A中，做为洗脱液(Phenylsepharose)。将洗脱液(Phenylsepharose)用缓冲液A注入老化过的MonoQ色谱柱(法马西亚(フマルマシァ)公司制的阴离子交换柱16×10cm)，用150ml浓度梯度为50～35mM的NaCl缓冲液A洗脱。PLD用浓度为210mM～235mM的NaCl洗脱。回收代表PLD活性的级分(分画)，将此溶液透析到缓冲液A上，做为洗脱液(MonoQlse)。将洗脱液(MonoQlst)用离心超级过滤浓缩至0.5ml，用浓度为0.1M的NaCl缓冲液A注入老化过的Superose6色谱柱[法马西亚(フマルマシァ)公司制1.0×30cm]，用同样的缓冲液洗脱。推测PLD的分子量为78KDa。回收代表PLD活性的级分，做为洗脱液(Superose6)。洗脱液(Superose6)中加入2.5ml40％的两性载体(Pharmacia.pH4.0-6.0)和蒸馏水至50ml，用Rotofore[巴伊屋拉多(バィオラッド)公司制]做等电点电泳。在2℃、12W恒定功率的条件下，电泳4个小时。PLD活性约为pH4.9。回收代表PLD活性的级分，将此溶液透析到缓冲液A中，做为等电点电泳试样。把等电点电泳试样用缓冲液A注入老化过的MonoQ色谱柱[法马西亚(フマルマシァ)公司制0.5×5cm]，用线性浓度梯度为50～35mM的NaCl缓冲液A洗脱。PLD用浓度约为210mM和235mM的NaCl洗脱。回收代表PLD活性的2个级分，做为洗脱液(MonoQ2nd-I、II)。通过SDS-聚丙烯酰胺(用7.5％的丙烯酰胺制得的)电泳[laemmli(1970)]来检验洗脱液(MonoQ2nd-I、II)的纯度。电泳后用染料考马斯亮兰R250将凝胶染色。发现洗脱液在任何情况下主带都在分子量为82KDa的位置上；洗脱液(MonoQ2nd-II)是单一带。通过以上纯化，洗脱液(MonoQ2nd-I、II)的纯化倍率分别是粗洗脱液的380倍、760倍。对2个级分进行酶的性状分析。其结果示于表1。用于测定最适宜pH值的缓冲液有醋酸钠(pH4-6)，MES-NaOH(pH5.5-7.0)，Tris-HCl(pH7-9)，均为100mM。pH值的稳定性是在25℃，各种pH值的条件下，放置30分钟后，测定其残留活性，看不出活性下降。温度的稳定性，是在4℃、25℃、37℃及50℃的各种温度条件下，放置30分钟后，测定其残留活性。在底物浓度为5mM的条件下测定底物的特异性，以酶对磷脂酰胆碱的作用为100的相对活性表示。表1</tables>2.证明纯化蛋白质是PLD与检验纯度一样，分别用SDS-聚丙烯酰胺电泳来分离洗脱液(MonoQ2nd-I、II)，转移到PVDF膜[Millipore公司制]上，然后染色。切下82Kda蛋白质带，用氨基酸序列分析仪(岛津制作所.PSQ-1)来测定N末端氨基酸序列。均可分析到10个残基，序列也相同。其序列如下所述。ValGlyLysGlyAlaThrLysValTyrSer在两个活性试样中看到的82KDa蛋白质的关系虽不明确，但至少氨基酸序列等级非常相似，在制备用来制作抗体的抗原时，使用两试样的混合液是没问题的。用SDS-聚丙烯酰胺(用7.5％的丙烯酰胺制得的)电泳来分离洗脱液(MonoQ2nd-I、II)的混合液，用考马斯亮兰染料将凝胶染色。切下82KDa的蛋白质带，用电洗脱(25mMTris、192mM乙氨酸、0.025％SDS、100V、10小时)回收。再用电透析(15mM碳酸氢铵、200V、5小时)除去SDS后，冷冻干燥。电洗脱、电透析时使用BIOTRAP(Schleicher和Schuell公司制)。把用上述方法高度纯化的82KDa蛋白质每隔7天，每次50μg给兔子进行免疫，用免疫前及免疫3次后的血清、进行免疫滴定实验。在8.6×10-3单位的PLD溶液中加入0～50μl的免疫前或免疫3次后的血清，50μl的250mMTris-HCl(pH7.0)，5μl的50mMCaCl2，50μl的0.2％TritonX-100(商品名)和水，总量为250μl，在室温下，放置2.5个小时。加入200μl的ProteinASepharose(Pharmacia)，在室温下缓慢振动2小时，然后离心(500×g、5分钟)测定上清液的酶活性。以不加血清时的酶活性为100％，加入20μl、50μl免疫前的血清，其酶活性分别为95％、88％、而加入20μl、50μl免疫3次后的血清，其酶活性分别为75％、30％。其结果证明了82KDa蛋白质为PLD。3.内部氨基酸序列的测定PLD蛋白质的片断化采用了在凝胶中电泳分离的方法[Clevelandetal，J.Biol.Chem.，252，1102(1977)]。将含有PLD蛋白质(用与2同样的方法提出的)的凝胶插到用肽分离制备的15％丙烯酰胺凝胶的电泳槽中，将PLD蛋白质量的1/10的金黄色葡萄球菌V8蛋白酶(和光纯药公司制)混合后，开始电泳。溴酚蓝到达凝胶的中央时，暂停电泳，30分钟后再开始电泳。电泳完以后转移到PVDF膜上，染色。在分子量为20、14、13、11及10KDa的位置上可以看到清晰的带型。切除分子量为20、14及13KDa的肽片断的带，用氨基酸序列分析仪测定氨基酸的序列。其序列如下所示20KdaAsnTyrPheHisGlVSerAspValAsn？ValLeu？ProArgAsnProAspAsp(Asp)？？lle14KdaThr？AsnValGlnLeuPheArgSerIleAspGlyGlyAlaAlaPheGlyPheProAspThrProGluGluAlaAlaLys？GlyLeuValSerGly13KdaIleAlaMetGlyGlyTyrGlnPheTyrHisLeuAlaThrArgGlnProAlaArgGlyGlnIleHisGlyPheArgMetAlaLeu？TyrGluHisLeuGlyMetLeu？AspValPhe(其中？-表示不能确定是氨基酸的残基()-表示很可能是其它的氨基酸的残基。)4.稻子未成熟的种子cDNA基因文库的制备根据SDS苯酚法，从开花5天后的未成熟的种子中萃取出所有的RNA，并用氯化锂沉淀进行调制。Poly(A)+RNA的调制是用Oligotex-dT30(宝酒造公司制)按制造商的说明书来进行的。把cDNA合成系统プラス[阿玛霞目(ァマシャム)公司制]、cDNA克隆系统λgt10[阿玛霞目(ァマシャム)公司制]用于cDNA克隆，但要把λZAPII载体[斯托拉塔金(ストラタジ-ン)公司制]做为克隆载体使用，把XLl-Blue做为宿主细胞使用。5.探针的制备利用DNA合成装置[阿甫拉依多巴依奥(ァプラィドバィオシステムズ)系统公司制]合成与PLD的氨基酸序列相应的寡核苷酸。其序列和与这些序列相应的氨基酸序列如下所述。20KF5′AAYTAYTTYCAYGG3′20KR15′RTCRTCRTCNGGRTT3′(其中R表示嘌呤类A或G，Y表示嘧啶类T或C，N表示G、A、T及C中任何一种)20KF是32种寡核苷酸的混合物，它包括了对在分子量为20KDa的肽中发现的氨基酸序列AsnTyrPheHisGly进行了编码的DNA碱基序列；20KR1是128种寡核苷酸的混合物，它包括了对在分子量为20KDa的肽中发现的氨基酸序列AsnProAspAsp(Asp)进行了编码的DNA碱基序列的互补链。cDNA合成反应液总体积为10μl，参与反应的物质有10ngpoly(A)+RNA，0.3μg的随机六聚体dN6、10U的RNA酶抑制剂[RNAGuard、法马西亚(Pharmacia)公司制]、1mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、1×PCR缓冲液(宝酒造公司制)、50mM的氯化镁以及100U的逆转录酶(M-MuLVRTase，BRL公司制)。在37℃下反应30分钟，然后在95℃下进行5分钟热处理，保持在冰上。进行聚合酶链式反应(PCR)时，以上述cDNA为模板，20KF和20KR1为引物。反应液的总容积为50μl，参与反应的物质有10μlcDNA合成反应液，50pmol各种引物的混合物，200μM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、1×PCR缓冲液(宝酒造公司制)及2.5UAmliTaqDNA聚合酶(宝酒造公司制)。按下述温度条件反应，反复进行30个循环；在DNA的PCR仪[拍金爱尔马·喜塔斯(パ一キンェルマ一シ一タス)公司制]中，94℃下，反应1分钟；40℃下，反应1分钟；72℃下，反应2分30秒钟。在2％的琼脂凝胶上将PCR产物分离，用溴化乙锭染色法检测几个片断。其中一个的长度为94bp，与预想的大小相同。从凝胶中提出PCR片断，在pUC19质粒中进行亚克隆。根据双脱氧法(该方法使用T7sequencing成套仪器)来决定做了亚克隆的PCR片断的DNA序列。在二个引物之间发现了对预测到的氨基酸的碱基序列进行了编码的DNA碱基序列。引物之间的DNA碱基序列和其编了码的氨基酸如下所述。CTCTGACGTGAACTGTGTTCTATGCCCTCGCSerAspValAsnCysValLeuCysProArg使用DNA5′末端标记的成套仪器MEGALABEL(宝酒造公司)让同位素32P[阿玛霞目(ァマシャム)公司制]掺入上述寡核苷酸，制成放射性寡核苷酸探针。6.含有PLD基因的克隆的筛选以上述放射性寡核苷酸为探针来筛选cDNA基因文库。杂交溶液是0.5M的磷酸钠缓冲液(pH7.2)，7％SDS，1mMEDTA，100μg/ml鲑鱼精子，将探针加到杂交溶液中，在45℃下，杂交16个小时。清洗液为0.3MNaCl、30mM柠檬酸钠，在45℃下，清洗2次，每次20分钟。分离阳性噬菌斑，按λZAPII克隆载体制造商给出的方法，在体外(invivo)对pBluescript质粒[斯托拉塔金(ストラタジ一ン)公司制]进行克隆。用双脱氧法决定碱基序列的部位，存在有对3.中测定的内部氨基酸地碱基序列进行编码的区域。7.测定5′末端区域的碱基序列6.中所写的方法不能分离包含全长的cDNA的克隆，所以用RACE法[Edwardsetal，NucleicAcidsRes.，19，5227-5232(1991)]来制备含有5′末端区的DNA片断。按着所附的说明5′-AmpliFINDERRACEKit[固伦铁固(クロ一ンテッケ)公司制]，以按6.测定的cDNA的碱基序列为基础，合成低聚DNA，用4中所述的方法制成的mRNA为模板，进行PCR。将PCR产物克隆在PCRII载体[因毕特罗金(ィンビトロジェン)公司制]上，用双脱氧法测定碱基序列。将这样决定了稻子PLD的cDNA的碱基序列及碱基序列编码，由此推测出的氨基酸序列示于序列表的序列2。译码推测是从示于序列表2的第182号碱基开始。其根据是36碱基上游存在终止密码子。8.与PLDcDNA克隆相应的PLD染色体组克隆的分离及引物区域的鉴定为了分离负责PLD基因的调节序列的染色体组DNA的克隆，要建立一个“舆光”稻的染色体文库；该PLD基因与在pBluescript质粒中进行克隆的按6.测定的PLDcDNA相对应。将“舆光”种子发芽长出来的叶DNA用MboI进行部分消化，通过蔗糖梯度离心分离，纯化出16～20kb的大的部分，使用λDASHII[斯托拉塔金(ストラタジ一ン)公司制]、GigapackIICold[斯托拉塔金(ストラタジ一ン)公司制]来建立基因文库。把PLDcDNA克隆做为探针来筛选染色体组文库。按6.所述内容进行筛选。但在65℃下，杂交16小时，用0.5×SSC、0.1％SDS的清洗液在65℃下清洗两次，每次20分钟。用双脱氧法测定杂交过的染色体组克隆的碱基序列，存在有与按6测定的cDNA序列相同的范围。复制开始的部位用7.所述的方法测定。在复制开始的位点旁边发现了“TATA”共有序列序列框。ATG编码开始的部位通过测定DNA序列来判断，则定为克隆的译码阅读框内的最上游的ATG密码子，还有在稻子中合成的mRNA的起始存在ATG密码子。杂交在cDNA克隆的染色体组克隆的部分DNA序列示于序列号3。在染色体组DNA中以ATG译码开始的密码子开始，鉴定了与其相应的cDNA序列重合的阅读框。启动子位于ATG编码开始密码子的上游，从紧靠其上游开始。9.内含子的确定以及基因表达作用的分析通过cDNA(序列号2)和染色体组(序列号3)的比较，明确了PLD的基因上有3个内含子。之后，调查了173bp内含子对发现植物细胞内的基因的影响。173bp内含子区(即序列号3中所示的碱基序列的第1666～第1838号碱基，将该序列示于序列号4)位于与mRNA的5′末端非编码区相应的位置上。合成每5个基数含有一个外显子部分的15聚体的引物(5′-ACCCGGTAAGCCCAG-3′，3′-CCCCCGCGTCCATCC-5′)，以染色体克隆为模板，采用“5.探针的制作”中所述的方法来进行PCR。将PCR产物亚克隆到PCRII载体上，将从这里用EcoRI酶切提出来的片断做平末端处理；然后装到质粒pBI221(东洋纺公司制)的SmaI位点(参照图1)。下面，根据已经报导[Shimamotoetal.Nature，338，274-276(1989)]的方法，将上述重组质粒导入稻子的培养细胞[Babaetal.PlantCellPhysiol。27，463-471(1986)]，测定β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性。如表2所示，发现由于内含子的导入，GUS活性增大了。如表3有所示，还发现了内含子反向进入时，GUS活性也增大。另外，利用内含子序列中的BgIII部位和pBI221的BamHI部位，根据用双酶提出的片断的长度来决定内含子的方向。表2原生质体的GUS活性<p>表3原生质体的GUS活性(pmolMU/min/mg蛋白)序列表序列号1序列长度183序列类型核酸序列种类基因组DNA起源生物名稻序列ACCCGGTAAGCCCAGTGTGCTTAGGCTAAGCGCACTAGAGCTTCTTGCTCGCTTGCTTCT60TCTCCGCTCAGATCTGCTTGCTTGCTTGCTTCGCTAGAACCCTACTCTGTGCTGCGAGTG120TCGCTGCTTCGTCTTCCTTCCTCAAGTTCGATCTGATTGTGTGTGTGGGGGGGCGCAGGT180AGG183序列号2序列长度3040序列类型核酸序列种类cDNA到mRNA起源生物名稻序列AGTCTCTCTTCTCCCGCAATTTTATAATCTCGATCGATCCAATCTGCTCCCCTTCTTCTT60CTACTCTCCCCATCTCGGCTCTCGCCATCGCCATCCTCCTCTCCCTTCCCGGAGAAGACG120CCTCCCTCCGCCGATCACCACCCGGTAGGGCGAGGAGGGAGCCAAATCCAAATCAGCAGC180CATGGCGCAGATGCTGCTCCATGGGACGCTGCACGCCACCATCTTCGAG229MetAlaGlnMetLeuLeuHisGlyThrLeuHisAlaThrIlePheGlu151015GCGGCGTCGCTCTCCAACCCGCACCGCGCCAGCGGAAGCGCCCCCAAG277AlaAlaSerLeuSerAsnProHisArgAlaSerGlySerAlaProLys202530TTCATCCGCAAGTTTGTGGAGGGGATTGAGGACACTGTGGGTGTCGGC325PheIleArgLysPheValGluGlyIleGluAspThrValGlyValGly354045AAAGGCGCCACCAAGGTGTATTCTACCATTGATCTGGAGAAAGCTCGT373LysGlyAlaThrLysValTyrSerThrIleAspLeuGluLysAlaArg505560GTAGGGCGAACTAGGATGATAACCAATGAGCCCATCAACCCTCGCTGG421ValGlyArgThrArgMetIleThrAsnGluProIleAsnProArgTrp65707580TATGAGTCGTTCCACATCTATTGCGCTCATATGGCTTCCAATGTGATC469TyrGluSerPheHisIleTyrCysAlaHisMetAlaSerAsnValIle859095TTCACTGTCAAGATTGATAACCCTATTGGGGCAACGAATATTGGGAGG517PheThrValLysIleAspAsnProIleGlyAlaThrAsnIleGlyArg100105110GCTTACCTGGCTGTCCAAGAGCTTCTCAATGGAGAGGAGATTGACAGA565AlaTyrLeuProValGlnGluLeuLeuAsnGlyGluGluIleAspArg115120125TGGCTCGATATCTGTGATAATAACCGCGAGTCTGTTGGTGAGAGCAAG613TrpLeuAspIleCysAspAsnAsnArgGluSerValGlyGluSerLys130135140ATCCATGTGAAGCTTCAGTACTTCGATGTTTCCAAGGATCGCAATTGG661IleHisValLysLeuGlnTyrPheAspValSerLysAspArgAsnTrp145150155160GCGAGGGGTGTCCGCAGTACCAAGTATCCAGGTGTTCCTTACACCTTC709AlaArgGlyValArgSerThrLysTyrProGlyValProTyrThrPhe165170175TTCTCTCAGAGGCAAGGGTGCAAAGTTACCTTGTACCAAGATGCTCAT757PheSerGlnArgGlnGlyCysLysValThrLeuTyrGlnAspAlaHis180185190GTCCCAGACAACTTCATTCCAAAGATTCCGCTTGCCGATGGCAAGAAT805ValProAspAsnPheIleProLysIleProLeuAlaAspGlyLysAsh195200205TATGAACCCCACAGATGCTGGGAGGATATCTTTGATGCTATAAGCAAT853TyrGluProHisArgCysTrpGluAspIlePheAspAlaIleSerAsn210215220GCTCAACATTTGATTTACATCACTGGCTGGTCTGTATACACTGAGATC901AlaGlnHisLeuIleTyrIleThrGlyTrpSerValTyrThrGlulle225230235240ACCTTGGTTAGGGACTCCAATCGTCCAAAACCTGGAGGGGATGTCACC949ThrLeuValArgAspSerAsnArgProLysProGlyGlyAspValThr245250255CTTGGGGAGTTGCTCAAGAAGAAGGCCAGTGAAGGTGTTCGGGTCCTC997LeuGlyGluLeuLeuLysLysLysAlaSerGluGlyValArgValLeu260265270ATGCTTGTGTGGGATGACAGGACTTCAGTTGGTTTGCTAAAGAGGGAT1045MetLeuValTrpAspAspArgThrSerValGlyLeuLeuLysArgAsp275280285GGCTTGATGGCAACACATGATGAGGAAACTGAAAATTACTTCCATGGC1093GlyLeuMetAlaThrHisAspGluGluThrGluAsnTyrPheHisGly290295300TCTGACGTGAACTGTGTTCTATGCCCTCGCAACCCTGATGACTCAGGC1141SerAspValAsnCysValLeuCysProArgAsnProAspAspSerGly305310315320AGCATTGTTCAGGATCTGTCGATCTCAACTATGTTTACACACCATCAG1189SerIleValGlnAspLeuSerIleSerThrMetPheThrHisHisGln325330335AAGATAGTAGTTGTTGACCATGAGTTGCCAAACCAGGGCTCCCAACAA1237LysIleValValValAspHisGluLeuProAsnGlnGlySerGlnGln340345350AGGAGGATAGTCAGTTTCGTTGGTGGCCTTGATCTCTGTGATGGAAGG1285ArgArgIleValSerPheValGlyGlyLeuAspLeuCysAspGlyArg355360365TATGACACTCAGTACCATTCTTTGTTTAGGACACTCGACAGTACCCAT1333TyrAspThrGlnTyrHisSerLeuPheArgThrLeuAspSerThrHis370375380CATGATGACTTCCACCAGCCAAACTTTGCCACTGCATCAATCAAAAAG1381HisAspAspPheHisGlnProAsnPheAlaThrAlaSerIleLysLys385390395400GGTGGACCTAGAGAGCCATGGCATGATATTCACTCACGGCTGGAAGGG1429GlyGlyProArgGluProTrpHisAspIleHisSerArgLeuGluGly405410415CCAATCGCATGGGATGTTCTTTACAATTTCGAGCAGAGATGGAGAAAG1477ProIleAlaTrpAspValLeuTyrAsnPheGluGlnArgTrpArgLys420425430CAGGGTGGTAAGGATCTCCTTCTGCAGCTCAGGGATCTGTCTGACACT1525GlnGlyGlyLysAspLeuLeuLeuGlnLeuArgAspLeuSerAspThr435440445ATTATTCCACCTTCTCCTGTTATGTTTCCAGAGGACAGAGAAACATGG1573IleIleProProSerProValMetPheProGluAspArgGluThrTrp450455460AATGTTCAGCTATTTAGATCCATTGATGGTGGTGCTGCTTTTGGGTTC1621AsnValGlnLeuPheArgSerIleAspGlyGlyAlaAlaPheGlyPhe465470475480CCTGATACCCCTGAGGAGGCTGCAAAAGCTGGGCTTGTAAGCGGAAAG1669ProAspThrProGluGluAlaAlaLysAlaGlyLeuValSerGlyLys485490495GATCAAATCATTGACAGGAGCATCCAGGATGCATACATACATGCCATC1717AspGlnIleIleAspArgSerIleGlnAspAlaTyrIleHisAlaIle500505510CGGAGGGCAAAGAACTTCATCTATATAGAGAACCAATACTTCCTTGGA1765ArgArgAlaLysAsnPheIleTyrIleGluAsnGlnTyrPheLeuGly515520525AGTTCCTATGCCTGGAAACCCGAGGGCATCAAGCCTGAAGACATTGGT1813SerSerTyrAlaTrpLysProGluGlyIleLysProGluAspIleGly530535540GCCCTGCATTTGATTCCTAAGGAGCTTGCACTGAAAGTTGTCAGTAAG1861AlaLeuHisLeuIleProLysGluLeuAlaLeuLysValValSerLys545550555560ATTGAAGCCGGGGAACGGTTCACTGTTTATGTTGTGGTGCCAATGTGG1909IleGluAlaGlyGluArgPheThrValTyrValValValProMetTrp565570575CCTGAGGGTGTTCCAGAGAGTGGATCTGTTCAGGCAATCCTGGACTGG1957ProGluGlyValProGluSerGlySerValGlnAlaIleLeuAspTrp580585590CAAAGGAGAACAATGGAGATGATGTACACTGACATTACAGAGGCTCTC2005GlnArgArgThrMetGluMetMetTyrThrAspIleThrGluAlaLeu595600605CAAGCCAAGGGAATTGAAGCGAACCCCAAGGACTACCTCACTTTCTTC2053GlnAlaLysGlyIleGluAlaAsnProLysAspTyrLeuThrPhePhe610615620TGCTTGGGTAACCGTGAGGTGAAGCAGGCTGGGGAATATCAGCCTGAA2101CysLeuGlyAsnArgGluValLysGlnAlaGlyGluTyrGlnProGlu625630635640GAACAACCAGAAGCTGACACTGATTACAGCCGAGCTCAGGAAGCTAGG2149GluGlnProGluAlaAspThrAspTyrSerArgAlaGlnGluAlaArg645650655AGGTTCATGATCTATGTCCACACCAAAATGATGATAGTTGACGATGAG2197ArgPheMetIleTyrValHisThrLysMetMetIleValAspAspGlu660665670TACATCATCATCGGTTCTGCAAACATCAACCAGAGGTCGATGGACGGC2245TyrIleIleIleGlySerAlaAsnIleAsnGlnArgSerMetAspGly675680685GCTAGGGACTCTGAGATCGCCATGGGCGGGTACCAGCCATACCATCTG2293AlaArgAspSerGluIleAlaMetGlyGlyTyrGlnProTyrHisLeu690695700GCGACCAGGCAACCAGCCCGTGGCCAGATCCATGGCTTCCGGATGGCG2341AlaThrArgGlnProAlaArgGlyGlnIleHisGlyPheArgMetAla705710715720CTGTGGTACGAGCACCTGGGAATGCTGGATGATGTGTTCCAGCGCCCC2389LeuTrpTyrGluHisLeuGlyMetLeuAspAspValPheGlnArgPro725730735GAGAGCCTGGAGTGTGTGCAGAAGGTGAACAGGATCGCGGAGAAGTAC2437GluSerLeuGluCysValGlnLysValAsnArgIleAlaGluLysTyr740745750TGGGACATGTACTCCAGCGACGACCTCCAGCAGGACCTCCCTGGCCAC2485TrpAspMetTyrSerSerAspAspLeuGlnGlnAspLeuProGlyHis755760765CTCCTCAGCTACCCCATTGGCGTCGCCAGCGATGGTGTGGTGACTGAG2533LeuLeuSerTyrProIleGlyValAlaSerAspGlyValValThrGlu770775780CTGCCCGGGATGGAGTACTTTCCTGACACACGGGCCCGCGTCCTCGGC2581LeuProGlyMetGluTyrPheProAspThrArgAlaArgValLeuGly785790795800GCCAAGTCGGATTACATGCCCCCCATCCTCACCTCATAGACGAGGAAGCACT2633AlaLysSerAspTyrMetProProIleLeuThrSer805810ACACTACAATCTGCTGGCTTCTCCTGTCAGTCCTTCTGTACTTCTTCAGTTTGGTGGCGA2693GATGGTATGGCCGTTGTTCAGAATTTCTTCAGAATAGCAGTTGTTACAGTTGTGAATCAT2753AAAGTAATAAGTGCAGTATCTGTGCATGGTTGAGTTGGGAAGAAGATCGGGGATGCAATG2813ATGCTTGTGAAGTTGTGATGCCGTTTGTAAGATGGGAAGTTGGGAACTACTAAGTAATTG2873GCATGATTGTACTTTGCACTACTGTTTAGCGTTGTTGATACTGGTTAACCGTGTGTTCAT2933CTGAACTTGATTCTTGATGCAGTTTGTGGCATTACCAGTTTATCATCGTTCTTCAGGAAA2993AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3040序列号3序列长度2799序列类型核酸序列种类基因组DNA起源生物名稻序列CAAGGGTGTACATAGATTTGTCTCGTAAAATAGTATTATAATATTATAAACTTATTACTC60TATCCGTTCTAAAATATAAGAACCTTATGACTGGATGGAACATTTCCTAGTACTACGAAT120CTGAACACATGTCTAGATTCATAGTACTAGGAAATGTCTCATCGCGGTACTAGGTTCTTA180TATTTTAGGATGGAGGGAGTTTAATATAAAACTAATGGTTAGAACTTTGAAAGTTTGATT240TTAAATGTCAAATATTTATGGCTGGAGGTAGTATAATATGTTTTTTTTGGGACGTAGACT300AGGTAGTATAATATGTTTGGTTGTGTTTAGATCCAATATTTGGATCCAAACTTCAGTCAT360TTTCCATCACATCAACTTGTCATATACACATAACTTTTCAGTCACATCATCCCCAATTTC420AACCAAAATCAAACTTTGCGCTGAACTAAACACAACCTTTGGGCCCGTTTAGTTCCCCAA480TTTTTTTCCCAAAAACATCACATCGAATCTTTGGACACATGCATGAAGCATTAAATATAG540ATAAAAAGAAAAACTAATTGCACAGTTATGGAGGAAATCGCGAGACGAATCTTTTAAGCC600TAATTAGTCCGTGATTAGCCATAAGTGCTACAGTAACCCAATTGTGCTAATGACGGCTTA660ATTAGTCTCCACAAGATTCGTCTCGCAGTTTCCAGGCGAGTTCTGAAATTAGTTTTTTCA720TTCGTGTCCGAAAACCCCTTCCGACATCCGGTCAAACGTTCGATATGACACCCACAAATT780TTCTTTTCCCCAACTAAACACACCCTTTATCTCTTACCCTCTGGCTCTTTCAGTAGGCAT840ATCCAAGACAGCTGGTAATGCAGGCTCGGACATAATTTGACAGTTACGTTCATGTGACCG900ACGGTTGATGCTAGTGCAACTGCAACATACTGTTCAGATGGATGTCCCAACGAGCTCAAA960ACAACTTAGGTGGCGCGTCGCGATTCATCAATAACTCAAATGGAAGCGCAAGTGCACGTA1020CGAAAATGACAGCGAGTGAGGTGGCGAGCCTCACCTTGGTGATCCCAACCGGATAAGCTA1080TGCATCAGCCAGTTTCGTGGGGCTGCACATTTCGTCGAACACCTGGAGTCCACGCCGCCG1140GCGACGTCGGCACAGCGCGCCCGCCCACCGCCCACGCACGCGCTTGACTCCACCCATGTT1200CTCCCTTCTCGACGCCCGCGAAGCCAGCGAACCGATCCGAGGAAGTCAAGCCCCCACCGC1260CACTTGGACCGACCTCGGGACGACGACGCCCCCGCGCTCTTCTAGACGCGCGGACGACGC1320GGGCGCTGGCTCCGCGACGCGACGTCGCGGTCATGGAGTAACCGCGACGGACAGATACTT1380CTACCCGTTTTTAACCTCGCCTCCTCCTCCTCCCGGCTCGAGATCCGTGGCCACGACGCG1440TGGTGGGAAACCGGGAACGACGTGCACGCACGCACACAGGGCAAGTTTCAGTAGAAAAAT1500CGCCGGCATCCAGATCGGGACAGTCTCTCTTCTCCCGCAATTTTATAATCTCGCTCGATC1560CAATCTGCTCCCCTTCTTCTTCTACTCTCCCCATCTCGGCTCTCGCCATCGCCATCCTCC1620TCTCCCTTCCCGGAGAAGACGCCTCCCTCCGCCGATCACCACCCGGTAAGCCCAGTGTGC1680TTAGGCTAAGCGCACTAGAGCTTCTTGCTCGCTTGCTTCTTCTCCGCTCAGATCTGCTTG1740CTTGCTTGCTTCGCTAGAACCCTACTCTGTGCTGCGAGTGTCGCTGCTTCGTCTTCCTTC1800CTCAAGTTCGATCTGATTGTGTGTGTGGGGGGGCGCAGGTAGGGCGAGGAGGGAGCCAAA1860TCCAAATCAGCAGCCATGGCGCAGATGCTGCTCCATGGGACGCTGCACGCC1911MetAlaGlnMetLeuLeuHisGlyThrLeuHisAla1510ACCATCTTCGAGGCGGCGTCGCTCTCCAACCCGCACCGCGCCAGCGGA1959ThrIlePheGluAlaAlaSerLeuSerAsnProHisArgAlaSerGly152025AGCGCCCCCAAGTTCATCCGCAAGGTTCGGACCCTTCTCCTTAATCTACTCGTC2013SerAlaProLysPheIleArgLys3035TTTGCTCTTGCTCTTTTTCTTTTGTGTCCCTTTCTTGTGTGTGCGTTTGCATGAGCCCGA2073ATTTGATCTGCTAGTGCACAGTACAGTCAGATACACTGAAACGATCTGGAAATTCTGGAT2133TATTAGGAAAAATAAAGAGGTAGTAGACAAGAATTGGAGATACTTTCTATCAAGATTGGT2193CTATTATGCTTGGCCATTTCTTGTTTGACCCAAGTACTTCTTTGAATCTAGAGTTTGCTG2253TGTGTGATGTGGTGTGTGTTTGTGTCACCAAAAATCTTCATTAGCTAAAACTGAAATTTT2313ATTTATTAACTGACCTACTAAAAATGTAGAGTTCTCTGTGTGTGATGTGTGCTTGTGTCA2373CCAAAAATCTTGATTTGATAGAGTTTTTATTTATTTATTAACTGACCTACTACAAATCTA2433TTGCTGTATGCTATGTGTGTCTGTATCACCTGAAATGCAATGTCTTCTTCTTTGTTGTTC2493TTGATCTAACACGTGAGCTCATGTCAACAGTTTGTGGAGGGGATTGAGGACACT2547PheValGluGlyIleGluAspThr40GTGGGTGTCGGCAAAGGCGCCACCAAGGTGTATTCTACCATTGATCTG2595ValGlyValGlyLysGlyAlaThrLysValTyrSerThrIleAspLeu45505560GAGAAAGCTCGTGTAGGGCGAACTAGGATGATAACCAATGAGCCCATC2643GluLysAlaArgValGlyArgThrArgMetIleThrAsnGluProIle657075AACCCTCGCTGGTATGAGTCGTTCCACATCTATTGCGCTCATATGGCT2691AsnProArgTrpTyrGluSerPheHisIleTyrCysAlaHisMetAla808590TCCAATGTGATCTTCACTGTCAAGATTGATAACCCTATTGGGGCAACG2739SerAsnValIlePheThrValLysIleAspAsnProIleGlyAlaThr95100105AATATTGGGAGGGCTTACCTGCCTGTCCAAGAGCTTCTCAATGGAGAG2787AsnIleGlyArgAlaTyrLeuProValGlnGluLeuLeuAsnGlyGlu110115120GAGATTGACAGA2799GluIleAspArg125序列号4序列长度173序列类型核酸序列种类基因组DNA起源生物名稻序列GTAAGCCCAGTGTGCTTAGGCTAAGCGCACTAGAGCTTCTTGCTCGCTTGCTTCTTCTCC60GCTCAGATCTGCTTGCTTGCTTGCTTCGCTAGAACCCTACTCTGTGCTGCGAGTGTCGCT120GCTTCGTCTTCCTTCCTCAAGTTCGATCTGATTGTGTGTGTGGGGGGGCGCAG17权利要求1.具有序列表中序列号1中所示的碱基序列的DNA片段以及对在该碱基序列中增加、插入、缺失或置换一个或多个核苷酸后而且对其下游的基因的表达有促进作用的分离的DNA片段。2.权利要求1所述的具有序列表中序列号1所示的碱基序列的DNA片段。3.权利要求1的具有序列表中序列号1所示的碱基序列的分离的DNA片段以及对该碱基序列增加、插入、缺失或置换一个或多个核苷酸后并且对其下游的基因的表达具有促进作用的DNA片段。4.权利要求3中所述的具有序列表中序列号4所示的碱基序列的DNA片段。5.包含权利要求1中所述的DNA片段和在其下游功能性连结的待表达的外源基因的重组载体。6.权利要求5中所述的包含前述的具有序列表中序列号1中所示的碱基序列的DNA片段的重组载体。7.权利要求5中所述的包含前述的具有序列表中序列号4中所示的碱基序列的DNA片段的重组载体。8.将权利要求3中所述的重组载体导入宿主细胞而表达上述外源基因的外源基因的表达方法。9.权利要求8的方法，其中包含前述的具有序列表中序列号1中所示的DNA片段。10.权利要求9的方法，其中之DNA为前述的具有序列表中1序列号4中所示的DNA片段。全文摘要本文公开了可大大促进外源基因表达的新DNA，它与已知的可促进外源基因表达的DNA序列不同。本发明提供了具有序列表中序列号1所示的碱基序列的分离出来的DNA片断；而且在该DNA碱基序列中，扩增、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸，都对其下游基因的表达有促进作用。文档编号C12N9/16GK1154141SQ96190520公开日1997年7月9日申请日期1996年3月28日优先权日1995年3月29日发明者森冈真二,植木润申请人:日本烟草产业株式会社