一种可表达vsv?g的重组毕赤酵母菌及其制备和应用
【专利摘要】本发明涉及一种可表达VSV?G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用，重组毕赤酵母菌具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV?G。制备方法包括（1）采用PCR反应从质粒pLP/VSV?G中克隆VSV?G基因片段；（2）制备重组质粒pGM?T?VSV?G；（3）制备重组质粒pPIC3.5K?VSV?G；（4）重组表达载体通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选阳性重组子；（5）取阳性重组子进行培养诱导离心收集菌体并用酸性玻璃珠裂解。本发明采取的表达策略为胞内表达，有效消除了甲醇对细胞裂解液的污染。利用毕赤酵母表达系统制备VSV?G蛋白，裂解液经过滤除菌后可直接用于细胞转染。为VSV?G的大批量制备提供了基础，也对VSV?G的研究及相应疾病治疗具有重要意义。
【专利说明】
一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及合成生物学技术，基因工程技术，尤其涉及一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]水疱型口炎病毒糖蛋白G(下称VSV-G)是锚定与水疱型口炎病毒(下称VSV)表面，并含有C末端跨膜结构的三聚体病毒膜蛋白。研究发现，VSV-G在介导水疱性口炎病毒进入宿主细胞上起主要作用，且水疱性口炎病毒感染物种的普遍性也与此蛋白有关。VSV-G在较低PH值的环境中会发生构象变化，该变化导致可促进病毒体进入被感染细胞的一系列反应，包括受体细胞识别和粘附，激活受体细胞内吞以及融合受体细胞膜，病毒最终在细胞中释放病毒遗传物质，进而扩增。
[0003]由于VSV感染物种的多样性和稳定性，其表面融合蛋白VSV-G已经被研究并用做假病毒体的制备，以介导向细胞内的物质传递。另外，当VSV-G被整合至人工脂质体膜上时，会形成一种类似病毒的运载体，可用于向靶细胞内运输生物大分子如抗体、DNA及一些复杂的细胞器，实验证实，该运载体的物质传递效率较高。
[0004]目前，VSV-G的制备方式主要为从VSV病毒体直接提取或制备转染了VSV-G基因的细胞条件培养液。然而，一些复杂耗时的步骤，如蔗糖密度梯度离心；以及细胞培养基的高成本限制了 VSV-G的大批量生产。
[0005]毕赤酵母(P.pas1ris)表达系统是近几年成功建立的，较为成熟可靠的蛋白质大批量生产工具。目前，很多生物活性物质已由该系统生产成功，如抗体和酶。由于转入毕赤酵母内的表达载体会以同源重组的方式整合在酵母基因组上，使得该系统具有外源基因遗传的稳定性。此外，毕赤酵母还具有成熟的蛋白修饰系统，分子操作简单易行和成本低廉等优势。此前，已有数种病毒膜蛋白在此系统中成功表达，如HIV-1表面蛋白gpl20，HBsAg和登革热病毒E蛋白。
[0006]由于VSV-G蛋白在基础研究和疾病治疗上具有重要意义，构建一种能够表达VSV-G的重组毕赤酵母工程菌对VSV-G的研究以及大规模制备奠定了基础。
【发明内容】
[0007]本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用解决现有技术存在的问题。
[0008]为了实现上述的目的，采用如下的技术方案:
一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌，具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV-G。
[0009]进一步的，所述VSV-G以生物活性的方式存在于所述毕赤酵母菌KM71的裂解液中。
[0010]所述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌中含有可表达VSV-G蛋白的基因序列，该序列如下:atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgcaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatcctteactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa
ο
[0011 ] VSV-G基因必须编码下列氨基酸序列:
MkcllylaflfigvnckftivfphnqkgnwknvpsnyhycpsssdlnwhndligtalqvkmpkshkaiqadgwmchaskwvttcdfrwygpkyithsirsftpsveqckesieqtkqgtwlnpgfppqscgyatvtdaeavivqvtphhvIvdeytgewvdsqfingkcsnyicptvhnsttwhsdykvkglcdsnlismditffsedgelsslgkegtgfrsnyfayetggkackmqyckhwgvrlpsgvwfemadkdlfaaarfpecpegssisapsqtsvdvsliqdveriIdysIcqetwskiraglpispvdlsylapknpgtgpaftiingtlkyfetryirvdiaapilsrmvgmisgttterelwddwapyedveigpngvlrtssgykfplymighgmldsdlhlsskaqvfehphiqdaasqlpddeslffgdtglsknpielvegwfsswkssiasfffiigliiglflvlrvgihlciklkhtkkrqiytdiemnrlgko
[0012]进一步的，上述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌的制备方法，主要包括以下步骤:
(I)采用PCR反应从质粒pLP/VSV-G中克隆VSV-G基因片段；
(2 )回收步骤(I)所得VSV-G基因片段，并将所述VSV-G基因片段与pGM-T载体进行T-A连接，转化入大肠杆菌Top 10,扩增培养，酶切检测并测序，得到重组质粒pGM-T-VSV-G，以获得EcoR頂每切位点；
(3)利用EcoRI对步骤(2)所得pGM-T-VSV-G酶切后得到VSV-G片段，连入表达载体PPIC3.5K，转化入大肠杆菌Top 10，扩增培养，酶切检测并测序，得到重组表达载体PPIC3.5K-VSV-G；
(4)将步骤(3)所得重组表达载体pPIC3.5K-VSV-G通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选，以阳性重组子； (5)取步骤(4)所得阳性重组子接种于BMGY液体培养基培养18-24 h，再转入BMMY培养基诱导培养96 h，离心收集菌体并用酸性玻璃珠裂解，再利用Western Blot检测蛋白表达情况，确认VSV-G蛋白的表达。
[0013]进一步的，所述PCR反应的引物和反应条件如下:
引物I(F): 5 ’-CCATGGCCTGTTGCTC CACCAGCTT-3 ’
引物2 (R): 5 ’ -AAGCTTTCAGCAGTGGCTCACAGCAG-3 ’
反应条件为:94°C预变性3 min;94°C解旋30 s，59.5°C I min，60°C延伸30 s，30个循环;72°C保温 10 min。
[0014]进一步的，步骤(5)所述BMMY培养基中含有1%甲醇;所述诱导培养过程时每隔24h补加甲醇一次。
[0015]—种上述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌的裂解液，能够促进哺乳动物细胞DNA转染。
[0016]—种上述裂解液制备方法，主要包括:将诱导后的可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌重悬于含有I mM PMSF的roS(20 mM, pH 7.4)中，加入等体积酸洗玻璃珠后，将混合物剧烈涡旋震荡I min，立即置于冰上I min;重复多次后混合物在4°C下离心收集上清，再用0.22μπι滤膜过滤。
[0017]—种上述裂解液的应用，用于介导DNA转染及其他相关领域中。该裂解液含有具有生物活性的VSV-G蛋白，能够有效提高DNA的转染效率。
[0018]酵母表达蛋白产物检测:利用WesternBlot技术对表达产物进行检测，具体步骤如下:酵母裂解液与PAGE Gel Loading Buffer混合，于沸水浴中加热lOmin，取10-20 μ?混合液，上样于SDS-PAGE凝胶(10%分离胶，5%浓缩胶)。电泳后利用半干转方式将蛋白转移至PVDF膜上。将膜漂洗后室温下与封闭液孵育I h;漂洗后转移至1:3000兔抗VSV-G—抗溶液中，4 °C孵育过夜;漂洗后在室温与I: 50000鼠抗兔的二抗孵育I h。漂洗后用ECL显色液曝光显色。
[0019]与现有技术相比，本发明制备VSV-G的方法具有操作相对简便，不需要复杂的实验步骤，重组毕赤酵母菌制备成功后可长期保存、反复使用；同时具有成本低廉的优势，不需要成分复杂且昂贵的细胞培养基。且诱导培养之后仅需对酵母菌进行裂解即可产出具有VSV-G生物活性的裂解液，可直接用于细胞实验。在DNA转染中，能够有效提高质粒DNA转染动物细胞的效率。本发明采取的表达策略为胞内表达，有效消除了甲醇对细胞裂解液的污染。本发明开创性地利用毕赤酵母表达系统制备VSV-G蛋白，这不但为VSV-G的大批量制备提供了基础，也对VSV-G的研究及相应疾病治疗具有重要意义。
【附图说明】
[0020]图1为本发明的可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌的制备方法示意图；
图2为本发明的酵母裂解液介导细胞间蛋白传递的检测和功能验证的荧光照片；
图3为本发明酵母裂解液与质粒pGL3-C0ntr0l孵育后转染Ad293细胞48 h后的效果统计图；
图4为本发明酵母裂解液与质粒pGL3-C0ntr0l孵育后转染HeLa细胞48 h后的效果统计图； 图5为本发明酵母裂解液与质粒pCMV-DsRed孵育后转染Ad293细胞24 h后的荧光照片；图6为本发明酵母裂解液与质粒pCMV-DsRed孵育后转染Ad293细胞24 h后的阳性细胞数量统计图；
图7为本发明酵母裂解液与质粒pCMV-DsRed孵育后转染HeLa细胞24 h后的荧光照片；图8为本发明酵母裂解液与质粒pCMV-DsRed孵育后转染HeLa细胞24 h后的阳性细胞数量统计图。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0022]实施例1
1、制备可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌的方法和步骤，如图1所示，主要包括以下步骤:
(1)采用PCR反应从质粒pLP/VSV-G中克隆VSV-G基因片段，引物和反应条件如下；
引物I(F): 5 ’-CCATGGCCTGTTGCTC CACCAGCTT-3 ’
引物2 (R): 5 ’ -AAGCTTTCAGCAGTGGCTCACAGCAG-3 ’
反应条件为:94°C预变性3 min;94°C解旋30 s，59.5°C I min，60°C延伸30 s，30个循环;72 °C 保温 1 min
(2)回收DNA片段，并将片段与pGM-T载体进行T-A连接，转化入大肠杆菌Top10,扩增培养，酶切检测并测序，得到重组质粒pGM-T-VSV-G;
(3)利用EcoRI对pGM-T-VSV-G酶切后得到VSV-G片段，连入表达载体pPIC3.5K，转化入大肠杆菌Top 10,扩增培养，酶切检测并测序，得到重组质粒pPIC3.5K-VSV-G;
(4)重组表达载体通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选阳性重组子；
(5)取阳性重组子接种于BMGY液体培养基培养18-24h，再转入BMMY(含1%甲醇)培养基诱导培养96 h(每隔24 h补加甲醇一次)。离心收集菌体并用酸性玻璃珠裂解，利用Western Blot检测蛋白表达情况。
[0023]2、酵母裂解液的制备，主要包括以下步骤:诱导后的可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌重悬于I ml含有I mM PMSF的I3BS (20 mM, pH 7.4)中，加入等体积酸洗玻璃珠后，将混合物剧烈涡旋震荡I min，立即置于冰上I min。该步骤重复10次。混合物在4°C下以13000g离心收集上清。该上清用0.22μπι滤膜过滤后即为酵母裂解液。
[0024]3、酵母表达蛋白产物检测:
利用Western Blot技术对表达产物进行检测，具体步骤如下:
酵母裂解液与PAGE Gel Loading Buffer混合，于沸水浴中加热10 min，取10-20 μ I混合液，上样于SDS-PAGE凝胶(10%分离胶，5%浓缩胶)。电泳后利用半干转方式将蛋白转移至PVDF膜上。将膜漂洗后室温下与封闭液孵育I h;漂洗后转移至1:3000兔抗VSV-G—抗溶液中，4 0C孵育过夜;漂洗后在室温与I: 50000鼠抗兔的二抗孵育I h ο漂洗后用ECL显色液曝光显色。
[0025]实施例2
酵母裂解液介导细胞间蛋白传递的检测和功能验证。
[0026]用pCAG-CreER和pCMV-DsRed/loxP2-EGFP分别转染Ad293细胞。转染后24h，将细胞消化，并以PCAG-CreER: pCMV-DsRed/loxP2-EGFP为2:1的比例铺于96孔板中。待细胞完全贴壁后，将上述实施例1获得的含有VSV-G的酵母裂解液用培养液加入到Ad293当中去，3 h后吸出80%裂解液并加入等体积柠檬酸钠缓冲液(pH5.4)室温孵育I min，吸出缓冲液，加入新鲜细胞培养液及10 mM的4-羟基它莫昔芬(4-HT)后置于37°C培养24 h，在荧光显微镜下观察。CreER融合蛋白可以从细胞质进入细胞核，并在1xP位点之间进行DNA重组，使受体细胞从红色转为绿色。从图2可以看到明显的EGFP阳性细胞，说明酵母裂解液能成功传递CreER融合蛋白，而且进入细胞后，能成功释放红色蛋白质，证明了VSV-G细胞膜颗粒能够有效传递蛋白质并发挥生物学功能。
实施例3
酵母裂解液促进质粒DNA转染。
[0027]用PolyJet与Lipofectamine 2000转染试剂按说明书要求与pGL3_control质粒孵育，分别转染Ad293与HeLa细胞。细胞以I X 14每孔的密度提前铺于96孔板中。转染试剂与DNA复合物加入细胞后，再加入酵母裂解液，于37°C培养12 h后换液，于48 h时进行荧光素酶检测。从图3和图4可以明显看出使用重组酵母菌裂解液孵育，转染时间为24 h时，Ad293细胞与HeLa细胞相对光强度单位(白色柱)均在5 μ?加入量处有最大值，约为空白对照的3倍。相应的，用野生型ΚΜ71裂解液孵育(黑色柱)时，则无明显的效果。
[0028]用PolyJet与Lipofectamine 2000转染试剂按说明书要求与pCMV-DsRed质粒孵育，分别转染Ad293与HeLa细胞。细胞以I X 14每孔的密度提前铺于96孔板中。转染试剂与DNA复合物加入细胞后，再加入酵母裂解液，于37°C培养12 h后换液，于48 h时一部分细胞在荧光显微镜下观察，另一部分细胞消化后用流式细胞仪统计发光细胞所占比例。从图5与图7可以看出，与VSV-G孵育后，Ad293与HeLa细胞红色数量显著增加;从图6与图8可以看出，Ad293红色数量占细胞总数的比例增加约10%，He La红色细胞数量占细胞总数的比例提升约I倍。上述实验结果表明，表达VSV-G的重组毕赤酵母裂解液能够有效提高哺乳动物细胞DNA转染效率。
[0029]以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
【主权项】
1.一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌，其特征在于，具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV-G。2.根据权利要求1所述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌，其特征在于，所述VSV-G以生物活性的方式存在于所述毕赤酵母菌KM71的裂解液中。3.根据权利要求2所述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤: (I)采用PCR反应从质粒pLP/VSV-G中克隆VSV-G基因片段； (2 )回收步骤(I)所得VSV-G基因片段，并将所述VSV-G基因片段与pGM-T载体进行T-A连接，转化入大肠杆菌Top 10,扩增培养，酶切检测并测序，得到重组质粒pGM-T-VSV-G，以获得EcoR頂每切位点； (3)利用EcoRI对步骤(2)所得pGM-T-VSV-G酶切后得到VSV-G片段，连入表达载体PPIC3.5K，转化入大肠杆菌Top 10，扩增培养，酶切检测并测序，得到重组表达载体PPIC3.5K-VSV-G； (4)将步骤(3)所得重组表达载体pPIC3.5K-VSV-G通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选，以阳性重组子； (5)取步骤(4)所得阳性重组子接种于BMGY液体培养基培养18-24h，再转入BMMY培养基诱导培养96 h，离心收集菌体并用酸性玻璃珠裂解，再利用Western Blot检测蛋白表达情况，确认VSV-G蛋白的表达。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述PCR反应的引物和反应条件如下:引物 I (F ): 5 ’ -CCATGGCCTGTTGCTC CACCAGCTT-3 ’引物2 (R): 5 ’ -AAGCTTTCAGCAGTGGCTCACAGCAG-3 ’ 反应条件为:94°C预变性3 min;94°C解旋30 s，59.5°C I min，60°C延伸30 s，30个循环;72°C保温 10 min。5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤(5)所述BMMY培养基中含有1%甲醇；所述诱导培养过程时每隔24 h补加甲醇一次。6.一种根据权利要求2所述可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌的裂解液，其特征在于，能够促进哺乳动物细胞DNA转染。7.根据权利要求6所述裂解液的制备方法，其特征在于，主要包括:将诱导后的可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌重悬于含有I mM PMSF的I3BS中，加入等体积酸洗玻璃珠后，将混合物剧烈涡旋震荡I min，立即置于冰上I min;重复多次后混合物在4°C下离心收集上清，再用0.22μηι滤膜过滤。8.根据权利要求6所述裂解液的应用，其特征在于，用于介导DNA转染。
【文档编号】C12N15/81GK106047739SQ201610488661
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】魏炽炬, 王靖荃, 董莹, 刘鑫, 李龙
【申请人】汕头大学