重组g-csf(15-75)多肽载体的构建及表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种G-CSF(15-75)多肽的表达载体构建及 其在毕赤酵母菌中的表达。
【背景技术】
[0002] 粒细胞刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的主要作用 是刺激中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化，增加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞 功能，化疗后肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩 短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。
[0003] G-CSF于1991年被美国FDA投放市场，用于治疗放疗后中性粒细胞减少症，现在已 经有多家在生产销售，并且开发出大肠杆菌表达复性的人G-CSF蛋白上市，长效的PEG化的 G-CSF也获得FDA的批准，国内开发的G-CSF二聚体F-627也已完成II期临床，并取得较好 的效果。
[0004] 中国专利CN03132702. 3中公开了表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的酵母重 组株及rhGM-CSF的纯化方法，其中将克隆修饰的M-CSF基因插入pGAPZa-A的载体中，最后 表达产物的比活性在3. 4X 107IU/mg以上。
[0005] 中国专利CN103233053A中公开了一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，采用 重组质粒PKG931作为表达载体，以大肠杆菌HB101作为受体菌，提高生产效率，蛋白纯度为 95 %左右，但是获得了重组人粒细胞刺激因子的表达量仅仅有50 %。
[0006] 中国专利CN103114115中公开一种一种重组人粒细胞集落刺激生长因子用微生 物筛选而制备的方法，其药物组合物及制剂选用重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌进行 发酵培养；对发酵培养基所得菌体进行超声破碎，收集包涵体，用包涵体洗涤液进行洗涤后 低温离心；包涵体中加入包涵体溶解液，4°C条件下8~12小时后，离心得到包涵体提取液； 采用SephacrylS-200凝胶柱对提取液进行分离，收集复性的重组人粒细胞集落刺激因子 馏分；再采用Sephade XG25柱进行分离，最终得到的的高纯度、高活性的G-CSF，但回收率只 有 47. 5%。
[0007] 中国专利CN103233053中该开一种一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，其中 公开了大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，所述大肠杆 菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为PKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵 罐培养，均采用含酵母和蛋白胨的无抗生素培养基，采用高压均质机破菌，经过变性、复性 和层析，得到G-CSF表达量为50 %。
[0008] 目前，国内生产的G-CSF大多数为大肠杆菌表达产物，使用大肠杆菌在生产过程 中需要复性，且复性率低，比活性也相对较低；使用聚乙二醇修饰的G-CSF，其生物活性会 下降；酿酒酵母工程菌株的表达属于非整合性表达，表达过程不稳定、产物表达量低和基因 容易丢失的缺陷。
【发明内容】
[0009] 针对以上缺陷，本发明的目的之一在于提供一种重组的表达G-CSF(15_75)多肽 载体及其该载体构建、表达方法，本发明通过对G-CSF (15-75)基因进行优化，该多肽含有 G-CSF生物功能所必需的活性中心，优化后的多肽片段较小，表达量在2. 8g/L以上，且比活 性为 1. 5X108IU/mg 以上。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供优化后G-CSF(15-75)基因以及优化后该基因编码 的氨基酸序列。
[0011] 本发明的第三个目的在于一种含有上述载体的重组毕赤酵母菌 pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115。
[0012] 本发明的第四个目的提供提供上述毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115的 制备方法。
[0013] 本发明的毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GSll已经于2015年4月13日在中 国普通微生物菌种保藏管理中心保藏（CGMCC)，并收到保藏登记号CGMCC N0 10713。
[0014] 本发明的保藏菌种为一株巴斯德毕赤酵母菌（Pichia pastoris)G-CSF(15_75) CGMCC NO : 10713。
[0015] 本发明的目的是通过如下方法实现的：
[0016] 首先，pPIC9K-G-CSF(15-75)表达载体的构建，本发明选取G-CSF中起生物学活性 所必需的的氨基酸序列，即第15至75氨基酸序列，包含2个完整的二硫键，利于保持其活 性。然后用毕赤酵母常偏爱密码子对所选氨基酸序列的G-CSF(15-75)多肽基因进行优化， 并在5'端加EcoR I位点和kex2酶切位点，3'端加TAA终止密码子和Not I位点。进一步 的，将优化的G-CSF (15-75)基因克隆入pP IC9K表达载体中，制备成pP IC9K-G-CSF (15-75) 表达载体，并将重组表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞DH5 a中，LB氨苄培养基筛选阳 性克隆。
[0017] 然后将pPIC9K-G-CSF(15-75)重组质粒线性化后电转化到毕赤酵母菌GS115中， 电转化的条件为2mm电击杯，电压1500v，电击时间5ms，再利用不同浓度的G418-YPD平 板筛选阳性克隆，对pP IC9K-G-CSF (15-75) -GS115菌落进行PCR鉴定，以验证目的基因 片段是否整合到毕赤酵母GS115中，所得Tricine-SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定 G-CSF(15-75)多肽的表达。
[0018] 本发明为了进一步验证G-CSF(15-75)多肽的作用，对重组毕赤酵母 pPIC9K_G_CSF(15-75)-GS115 进行 30L 上罐发酵，发酵液经过 phenyl sephrose 6fast flow疏水层析柱纯化、DEAE sephrose fast flow层析柱纯化、Syperdex75层析柱纯化， 所获得的纯品按照"中华人民共和国药典三部"方法测定其生物学比活性在1. 5X108IU/mg 以上。
[0019] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0020] (1)采用pPIC9K-G-CSF(15-75)最为表达载体，并将其整合到毕赤酵母GS115中， 利用毕赤酵母菌PPIC9K-G-CSF (15-75) -GS115作为表达G-CSF (15-75)多肽的工程菌，所得 到的G-CSF(15-75)多肽片段小且分泌表达，表达量在2. 8g/L以上。
[0021] (2)G-CSF(15-75)多肽直接分泌到培养液中，纯化方法简单，经过普通的疏水层 析、阴离子交换和凝胶过滤之后，经HPLC检测蛋白纯度在99. 5 %以上，适合工业化生产。
[0022] (3)G-CSF(15_75)多肽表达量较高，易于纯化，纯化后纯品的生物学比活性在 1. 5X108IU/mg 以上。
[0023] (4)采用毕赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115作为发酵菌种，整个发酵过程 需要的时间为100小时，发酵周期较短，适用于工业化生产。
【附图说明】
[0024] 图l、pPIC9K-G-CSF(15_75)多肽质粒载