表达鸭坦布苏病毒e蛋白的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病 毒及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 2010年4月以来，我国鸭主产区的蛋鸭和种鸭爆发一种新的传染病，该病以传 播迅速、产蛋量骤降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征。通过病原分离鉴 定和全序列测定，明确该病原属于黄病毒科（Flaviviridae)、黄病毒属（Flavivirus)、蚊 媒病毒类（Mosquito-borne)、Ntaya病毒群，与该群Tembusu病毒（TMUV)具有最近的 遗传进化关系，可以认为是TMUV的一个新成员，暂定名为鸭坦布苏病毒（DuckTembusu virus,DTMUV)(SuJ,LiS,HuX,etal.Duckegg-dropsyndromecausedbyBYDvirus,a newTembusu-relatedflavivirus[J].PLoS0ne,2011,6(3):el8106)。该病可危害不 同品种的种鸭和蛋鸭，发病率高低不一，群内发病率高达100%，死淘率5%~15%，继发 感染时死淘率可达30% (曹贞贞，张存，黄瑜，等.鸭出血性卵巢炎的初步研究[J]. 中国兽医杂志，2010,46(12) :3_6.)(CaoZ,ZhangC,LiuY，etal.Tembusuvirusin ducks，china[J].EmergingInfectiousDiseases, 2011，17 (10): 1873-1875.)。临床上主 要表现为发病后2~5d内，鸭群的产蛋量骤然下降，从产蛋高峰迅速下降至30%~10%， 严重的甚至停产。研究发现，该病毒主要危害除番鸭外的所有品种产蛋鸭、肉种鸭及野鸭 等，最近也有产蛋鸡（陈仕龙，陈少莺，王劭，等.一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒 的分离与初步鉴定[J].福建农业学报，2011，26(2): 170-174.)、鹅自然感染发病的报道 (赵冬敏，黄欣梅，刘宇卓，等.新型黄病毒在种鹅中垂直传播的研究[J].南方农业学 报，2012, 43 (1) :99-102.)。该病的流行给养殖业造成了巨大的损失，而目前尚没有有效的 疫苗及药物控制该病的发生。
[0003] 随着病原学研究的深入和病毒基因组的破译，发现该病毒对鸡红细胞无血凝活 性，病毒直径约45nm，有囊膜。病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，由10990个核苷酸 组成，具有典型的黄病毒基因组结构特点。病毒基因组编码一个大多聚蛋白，由3426个氨 基酸构成，该多聚蛋白前体经过病毒自身和宿主细胞的蛋白酶，被切割成至少十种成熟的 蛋白，其中包括3个结构蛋白（核衣壳蛋白C、膜蛋白prM、囊膜蛋白E)和7个非结构蛋 白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b与 NS5)(YunT，YeW，NiZ，etal.Identification andmolecularcharacterizationofanovelflavivirusisolatedfromPekin ducklingsinChina[J].VeterinaryMicrobiology，2012, 157(3-4) :311_319.)。E蛋白 全长501个氨基酸，位于成熟病毒颗粒表面，构成病毒颗粒的突起。E蛋白是黄病毒的主要 结构蛋白，在病毒感染靶细胞的受体结合、膜融合和侵入过程中起着关键作用；同时，E蛋 白具有较好的免疫原性和反应原性，是宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，也是检测该病 毒特异性抗体的理想革E抗原（GublerDJ，KunoG,MarkoffL.Flaviviruses.InFields Virology.KnipeDM,andHowleyPM(eds).Philadelphia:LippincottWilliamsand Wilkins,2007:1153-1252.)〇
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒，具有制备双联疫苗 的潜质。
[0005] -种重组鸭瘟病毒，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有鸭坦布苏病毒E蛋白基 因，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDN0.9所示。
[0006] 优选的，所述基因组插入有Pcmv-E-BGH-pA表达框；其中E表示鸭坦布苏病毒E蛋 白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp 基因的CMV启动子替换为EF1启动子。
[0007] 优选的，所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因 之间。
[0008] 优选的，所述的以鸭瘟病毒的疫苗株作为活载体。鸭瘟病毒作为病毒活载体具有 疫苗生产、储存和免疫技术成熟，且安全性良好的优势。
[0009] 本发明还提供了一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0010] (1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EFl;
[0011] (2)将Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EFl，获得pDEV-E;
[0012] (3)将pDEV-E转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒；
[0013] 其中pDEV-vac为携带鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体，E表示 鸭坦布苏病毒E蛋白基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾； 一般情况下P起始表示质粒，r起始表示病毒；
[0014] 所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDN0.9所示。
[0015] 所述CMV启动子替换成EF1启动子的方法为：
[0016] (1)以pEP-EFl-in为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2的引 物，扩增获得目标片段；
[0017] (2)将所述目标片段转入pDEV-vac/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得 pDEV-kanEFl；
[0018] (3)敲除pDEV-kanEFl中的kan抗性基因，获得pDEV-EFl;
[0019] 所述的pEP-EFl-in质粒图谱如图6所示；
[0020] 所述的pDEV-vac/GS1783 为携带pDEV-vac的大肠杆菌GS1783。
[0021] 所述Pcmv-E-BGH-pA表达框插入pDEV-EFl的方法为：
[0022] (1)人工合成所述鸭坦布苏病毒E蛋白基因，插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-E;
[0023] (2)以pEP-BGH-E为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引 物，扩增获得目标片段；
[0024] (3)将所述目标片段转入pDEV-EFl/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得 pDEV-kanE；
[0025] (4)敲除pDEV-kanE中的kan抗性基因，获得pDEV-E;
[0026]所述的pEP-BGH-end质粒图谱如图7所示。
[0027] 本发明在鸭瘟病毒疫苗株的基础上，结合RedE/T重组技术将pDEV-vac上gfp基 因的CMV启动子替换为EF1启动子，以便于E基因准确插入到pDEV-EFl的预期位置，同时 有利于启动E基因的表达。该技术不需要特定的限制性酶切位点，只需较短的同源序列，即 可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。
[0028] 本发明又提供了所述的重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。
[0029] 本发明得到的重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异， 说明鸭坦布苏病毒E蛋白基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的扩散。
[0030] 本发明得到的重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达E蛋白，为鸭瘟病 毒-鸭坦布苏病毒二联疫苗的研制奠定了基础。
【附图说明】
[0031] 图1为重组克隆pDEV-EFl的XbaI酶切鉴定图，其中1 :pDEV-EFl;2: pDEV-kanEFl;3 :pDEV_vac〇
[0032] 图2为重组克隆pDEV-E的BamHI和XbaI酶切鉴定图，其中a为以参考序 列GenBank(EU082088. 2)进行预测的结果，b为电泳图谱；1 :pDEV-vac;2 :pDEV-EFl;3: pDEV-E。
[0033] 图3为荧光显微镜下（100X)重组病毒出现的荧光噬斑图，其中a:rDEV-BAC;b: rDEV-EFl;c:rDEV-E。
[0034] 图4为rDEV-BAC、rDEV-EFl和rDEV-E在CEFs上的蚀斑面积测定及比较图。
[0035] 图5为Westernblotting方法检测rDEV-E病毒感染细胞中E蛋白的表达图，其 中 1 :rDEV-EFl;2 :rDEV-E。
[0036] 图6为pEP-EFl-in载体质粒图谱。
[0037] 图7为pEP-BGH-end载体质粒图谱。
【具体实施方式】
[0038] 下列实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学 实验指南》（F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学 出版社，2004)中所述的方法进行。
[0039]1、序列优化、引物设计及合成
[0040] 鸭坦布苏病毒E基因序列参考GenBank(JF270480. 1)，由GenScript公司以鸡为宿 主进行优化合成；引物分别参考序列GenBank(EU082088. 2)、鸭坦布苏病毒E基因优化序列 设计，由上海生工合成；
[0041] 引物EF1-印1和EF1-印2用于以EF1启动子替换pDEV-vac中gfp基因的启动子 Pcmv，构建pDEV-EF1。下划线部分与pEP-EF1 -in质粒序列同源，斜体序列分别和pDEV-vac 序列中gfp基因的启动子Pcmv上、下游序列同源；
[0042]引物 pDEVvac-in-s和 pDEVvac-in-as用于将表达框 Pcmv-E-BGH-pA插入到 DEV 基因组的US7基因和US8基因之间。下划线部分与pEP-BGH-E同源，粗体部分分别与位于 US7和US8基因间插入位点上、下游的序列同源；
[0043]引物EF1-JD-F和EF1-JD-R用于EF1启动子替换是否成功的鉴定；
[0044] 引物Rec-JD-F和Rec-JD-R用于外源基因插入BAC基因组中的验证。
[0045]表1
[0046]
[0047] 2、pDEV-vac的CMV启动子替换成EF1启动子
[0048] 本发明所用的携带有鸭瘟病毒疫苗株全基因组感染性细菌人工染色体（BAC) 克隆的pDEV-vac/GS1783菌株是由浙江省农业科学院畜牧研究所构建并保存（Chen L,YuB,HuaJ,etal.Constructionofafull-lengthinfectiousbacterial artificialchromosomecloneofduckenteriti