将非神经元细胞重编程为神经元样细胞的方法和组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域中将非神经元细胞重编程为神经元样细胞的方法和组 合物。
【背景技术】
[0002] 在再生医学上，一个主要的问题是如何获得可定制的功能性细胞类型。近年来，直 接谱系重编程已经作为操纵细胞命运的新方法出现，这种方法很有前景，在操纵细胞命运 上快而且直接，并且能够绕开涉及多能干细胞操作所可能导致的致瘤性风险。通过病毒介 导的已知的细胞命运决定的转录因子或microRNA，成纤维细胞能够被直接转变为不同类别 的功能细胞类型（Davisetal.，1987;Vierbuchenetal.，2010;Xuetal.，2015;Yooet al.，2011)。这种直接重编程方法已经被用在疾病模型上，预示在再生医学上潜在的重要应 用价值（Xuetal.，2015)。并且，在体内原位直接重编程细胞命运也预示着治疗疾病的重 要前景（Xuetal.，2015)。尽管如此，但是，低效率的诱导，技术操作上的繁杂以及使用病 毒载体操作带来的基因组整合的风险已经引发了对这些方法在未来实用性的担忧。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何直接将非神经元真核细胞重编程为神经元样 细胞（即如何将非神经元真核细胞转变为神经元样细胞）。
[0004] 为了解决以上技术问题，本发明提供了可以将部分分化或完全分化的非神经元真 核细胞重编程为（转变为）神经元样细胞的一组小分子，该组小分子为赋予非神经元真核 细胞神经元样特性的一组化合物或诱导非神经元真核细胞转变为神经元样细胞的一组化 合物。将该组小分子命名为神经元样特性化学诱导剂，简称为CINPs。CINPs的分子量低于 2000道尔顿，如低于1500道尔顿、低于1000道尔顿、低于或等于900道尔顿或低于或等于 500道尔顿。
[0005] 本发明提供了使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物，所述组合物包括 神经元样特性化学诱导剂（CINPs)，所述神经元样特性化学诱导剂包括下述1)-6)中的任 意组合：
[0006] 1)环腺苷单磷酸（CAMP)激动剂；
[0007] 2)促神经发生小分子（neurogenicsmallmolecules);
[0008] 3)糖原合成激酶（GSK)抑制剂（glycogensynthasekinase(GSK)inhibitors);
[0009] 4)TGF0 受体抑制剂（TGF0receptorinhibitors);
[0010] 5)BET家族溴结构域抑制剂（BETfamilybromodomaininhibitors);
[0011] 6)选择性Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（selectiveinhibitorof Rh〇-associated，coiled_coilcontainingproteinkinase，ROCK)抑制剂和 / 或p38 丝 裂原活化激酶抑制剂；
[0012] 其中，所述6)是选择性组分。
[0013] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述6)在能促进非神 经元真核细胞向神经元样细胞转变的使用量下可选择加入。
[0014] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物可诱导非神经元真核细胞 获得神经元样特性，可用于制备将非神经元真核细胞重编程为神经元样细胞的培养基。
[0015] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述非神经元真核细胞 为哺乳动物非神经元真核细胞，所述组合物的活性成分可为下述Cl、C2、C3、C4、C5或C6 :
[0016] C1、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制 剂、和BET家族溴结构域抑制剂组成；
[0017] C2、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制 剂、所述TGFP受体抑制剂和BET家族溴结构域抑制剂组成；
[0018] C3、由所述环腺苷单磷酸激动剂、所述促神经发生小分子、所述糖原合成激酶抑制 剂、和所述TGFP受体抑制剂组成；
[0019] C4、由所述C1和所述6)组成；
[0020] C5、由所述C2和所述6)组成；
[0021] C6、由所述C3和所述6)组成。
[0022] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述环腺苷单磷酸 激动剂（cAMP激动剂）包括，但不限于前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)，咯利普 兰（rolipram)(例如，使用浓度可为50iiM)，金雀异黄素（genistein)、双丁酰环腺苷单 磷酸（Dibutyryl-cAMP，DBc-AMP)(例如，使用浓度可为10yM)或8-溴-环腺苷单磷酸 (8_Brom〇-cAMP)(例如，使用浓度可为200iiM)和佛司可林（Forskolin，F)。佛司可林的使 用浓度可为 5-500yM,如 20-300yM、20-200yM、50-100yM、20yM, 40yM, 60yM, 80yM，1 00yM, 120yM, 140yM, 160yM, 180yM或 200yM〇
[0023] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述促神经发生小分子 可为N-环丙基 _5_ (2-噻吩基）_3_ 异恶挫甲酰胺（N-Cyclopropyl-5- (2-thienyl) _3_is oxazolecarboxamide，ISX9,I)。ISX9 的使用浓度可为 5-100yM,如 10-40yM、10-20yM、 5yM, 10yM, 15yM, 20yM, 25yM, 30yM, 35yM，40yM，45yM或 50yM〇
[0024] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述糖原合成 激酶抑制剂可为下述四种物质中的至少一种：6_ [2- [4- (2, 4-二氯苯基）-5- (4-甲 基-1H-咪唑-2-基）嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈（6-[[2-[[4-(2,4-Di chlorophenyl)-5- (5-methyl-lH-imidazo1-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl] amino]-3-pyridinecarbonitrile，CHIR99021，C) ;CHIR99021 三盐酸盐（CHIR99021 trihydrochlo;ride)3-(2,4-二氯苯基）-4_(l-甲基-1H-H引噪-3-基）_1H_P比 略-2,5_ 二酮（3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(l-methyl-lH-indol-3-yl)-lH-pyr;role -2, 5-dione，SB216763);GSK31 抑制剂XV(GSK31inhibitorXV) ;GSK-3 抑制剂IX [((2Z,3E)-6' -bromo-3-(hydroxyimino)-[2,3' -biindolinylidene]-2' -one];GSK3 IX[6-Bromoindirubin-3'-oxime] ;GSK-30InhibitorXII[3- [ [6- (3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol] ;GSK_3 抑制剂XVI[6-(2-(4_(2, 4-dichlo rophenyl)-5_(4-methyl-lH-imidazol_2-yl)-pyrimidin-2-ylamino)ethyl-amino)-nic otinonitrile] ；SB-415286[3-[ (3-chlor0-4-hydroxyphenyl)amino]~4~(2-nitroph enyl)-lH-pyrrole-2,5-dione]；andBio[(2'Z, 3'E)-6-bromoindirubin-3'-oxime] 和（2'Z, 3'E)_6_ 溴館玉红-3' -丙酮月亏（（2'Z, 3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetox ime，Bio-acetoxime)。CHIR99021 的使用浓度可为 2-100yM,如 5-50yM、10-20yM、 2-10yM、2yM、5yM、10yM、15yM、20yM、25yM、30yM、35yM、40yM、45yM或 50yM〇 Bio-acetoxime的使用浓度可为lyM。GSK31XV的使用浓度可为0.4yM。SB216763的使 用浓度可为10yM。
[0025] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述TGF0受体抑制 剂包括但不限于（4-[4-(1，3-苯并二唑-5-基）-5-(2_吡啶基）-lH-咪唑-2-基]-苯 酰胺水合物）（4-[4-(l，3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-lH-imidazol-2-yl] benzamide, SB431542, S) ；E-616452[2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-lH-pyrazol-4-yl)-1, 5-naphthyridine] ；A 83-01[3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl) -lH-pyrazole-1-carbothioamide] ；SB 505124[2-[4_(1, 3-Benzodioxol_5-yl)-2-(l，l_d imethylethyl)-lH-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine]；Gff788388[4-[4-[3-(2-Pyri dinyl)-lH-pyrazol-4-yl]-2-pyridinyl]-N-(tetrahydr〇-2H-pyran_4-yl)-benzamide]; SB 525334[6-[2-(1, 1-Dimethylethyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-lH-imidazol-4-yl] quinoxaline],和 dorsomorphine。SB431542 的使用浓度可为 l_50iiM，如 2_40iiM 或 2-10yM或 10yM〇
[0026] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述BET家族溴 结构域抑制剂为下述物质中的至少一种：7_(3, 5-二甲基异噁唑-4-基）_8_甲氧 基-l-((R)-l-(吡啶-2-基）乙基）-lH-咪唑并[4,5-C]喹啉-2(3H)_ 酮（7-(3,5-dime thylisoxazol-4-yl)-8-methoxy-l-((R)-1-(pyridin-2-yl)ethyl)-lH-imidazo[4, 5_c] quinolin-2(3H)_one，I-BET151，B) ;I-BET151 的氢氯化物（I-BET151hydrochloride); ((63)-(4-(4-氯苯基）-2,3,9-三甲基-611-噻吩并[3,2-幻[1，2,4]三唑并[4,3- &][1，4] 二氮杂卓-6-基）乙酸叔丁酯）（(6S)-4-(4-Chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thien 〇[3, 2-f][1, 2, 4]triazolo[4, 3-a][1, 4]diazepine-6-aceticacid1, 1-dimethylethyl ester,JQ1)；PFI1[2-methoxy-N-(3_methyl-2-0x0-l, 2, 3, 4-tetrahydroquinazolin_6-丫1)匕611261168111；1^0仙1111(16];131'01]108卩01'；[116和1-[ 7-(3,4-二甲氧基苯基）-9-[[(33)-1-甲 基哌啶-3-基]甲氧基]-2, 3, 4, 5-四氢-1，4-苯并氧氮杂卓-4-基]丙烷-1-酮 (1- [7_ (3, 4-Dimethoxyphenyl) _9_ [ [ (3S) -l-methylpiperidin-3-yl]methoxy] _2, 3, 4, 5_ tetrahydr〇-l, 4-ben zoxazepin-4-yl]propan-1-〇ne,I-CBP112)；
[0027] 和/或，所述6)为下述四种物质中的至少一种：（+)-(R)_反式-4_(1-氨基乙 基）-N- (4-吡啶基）环己烧甲酰胺二盐酸盐（(+) - (R) -trans-4- (1-aminoethy 1) -N- (4-pyr idyl) cyclohexanecarboxamidedihydrochloride，Y27632)，法舒地尔，达马莫德（BIRB796) 和（4_(4,-氟苯基）-2-(4' -甲基亚磺酰基苯基）-5-(4' -吡啶基）-咪唑）（SB203580)。 I-BET 151 的使用浓度可为 2-100 yM,如 5-50 yM、5-20 yM、2-10 yM、2 yM、5 yM、10 yM、 15 yM、20 yM、25 yM、30 yM、35 yM、40 yM、45yM或 50 yiLPFI 1 的使用浓度可为 5yM，JQ1 的使用浓度可为1 yM，Bromosporine的使用浓度可为1 yM, I-CBP112的使用浓度可为 10yM〇
[0028] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述组合物可为C1、C2、 C3 或C4 ;
[0029] 所述Cl由所述F、所述I、所述C和所述B组成；所述Cl中，所述F、所述I、所述C 和所述B的摩尔比可为（50-100): (10-20) : (10-20) : (0.5-10)或 100: (10-20) : (10-20): (0? 5-2)或 100 :20 :20 : (0? 5-2)或 100 :20 :20 :2 ;
[0030] 所述C2由所述F、所述I、所述C、所述S和所述B组成；所述C2中，所述F、所述 I、所述C、所述S和所述B的摩尔比可为（50-100): (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0.5-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 : 10 ：2 ；
[0031] 所述C3由所述F、所述I、所述C和所述S组成；所述C3中，所述F、所述I、所述 C和所述S的摩尔比可为（50-100) : (10-20) : (10-20) : (2-10)或 100 : (10-20) : (10-20): (2-10)或 100 :20 :20 : (2-10)或 100 :20 :20 :10 ;
[0032] 所述C4由所述C1和所述6)组成组成，所述6)为下述四种物质中的一种：所述 Y27632、法舒地尔、达马莫德和所述SB203580 ;所述C4中，所述C1以F计和所述6)的摩尔 比可为（50-100) :2 或 100 :2。
[0033] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述神经元样特性可为 下述P1、P2和P3中的至少一种：
[0034] P1、具有神经元形态；
[0035] P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种： TUJ1 (神经特异III类0 -微管蛋白），MAP2 (微管相关蛋白2)，NF-H(神经丝H、重链神经丝 蛋白），NeuN(神经元核蛋白），vGlut(囊泡谷氨酸转运体）和Gad67 (谷氨酸脱羧酶67);
[0036] P3、由膜片钳检测到膜去极化。
[0037] 上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物中，所述非神经元真核细胞 可为下述任一种细胞：成纤维细胞，多能干细胞，血液来源细胞，胚胎来源细胞，皮肤来源细 胞，脂肪组织来源细胞，脂肪细胞，上皮细胞，内皮细胞，间充质细胞，实质细胞，小肠上皮细 胞和结缔组织细胞。
[0038] 含有上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物的产品也属于本发明 的保护范围，所述产品使非神经元真核细胞获得神经元样特性；所述神经元样特性为下述 P1、P2和P3中的至少一种：
[0039] P1、具有神经元形态；
[0040] P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种： TUJ1 (神经特异III类0 -微管蛋白），MAP2 (微管相关蛋白2)，NF-H(神经丝H、重链神经丝 蛋白），NeuN(神经元核蛋白），vGlut(囊泡谷氨酸转运体）和Gad67 (谷氨酸脱羧酶67);
[0041] P3、由膜片钳检测到膜去极化。
[0042] 含有上述使非神经元真核细胞获得神经元样特性的组合物的产品具体可为R1或 R2 ；
[0043] R1、含有所述组合物的成套真核细胞培养基；
[0044] R2、含有所述组合物的试剂盒。
[0045] 上述试剂盒还可以包括用于添加所述组合物的真核细胞培养基。
[0046]上述组合物或上述产品在将非神经元真核细胞重编程（转变）为神经元样细胞中 的应用也属于本发明的保护范围，所述神经元样细胞为具有神经元样特性的细胞，所述神 经元样特性为下述PI、P2和P3中的至少一种：
[0047] P1、具有神经元形态；
[0048] P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种： TUJ1，MAP2,NF-H，NeuN，vGlut和Gad67 ;
[0049] P3、由膜片钳检测到膜去极化。
[0050] 本发明还提供了将非神经元真核细胞重编程（转变）为神经元样细胞的方法。
[0051] 本发明所提供的将非神经元真核细胞重编程（转变）为神经元样细胞的方法，包 括将离体的非神经元真核细胞（待重编程细胞或起始细胞）在含有所述组合物的神经元诱 导培养基中培养使所述非神经元真核细胞转变为神经元样细胞；所述神经元样细胞为具有 神经元样特性的细胞，所述神经元样特性为下述PI、P2和P3中的至少一种：
[0052] P1、具有神经元形态；
[0053] P2、表达神经元标记蛋白，所述神经元标记蛋白为如下六种蛋白中的至少一种： TUJ1，MAP2,NF-H，NeuN，vGlut和Gad67 ;
[0054] P3、由膜片钳检测到膜去极化。
[0055] 上述应用或方法中，所述非神经元真核细胞可为下述任一种细胞：成纤维细胞，多 能干细胞，血液来源细胞，胚胎来源细胞，皮肤来源细胞，脂肪组织来源细胞，脂肪细胞，上 皮细胞，内皮细胞，间充质细胞，实质细胞，小肠上皮细胞和结缔组织细胞。
[0056] 上述应用或方法中，所述非神经元真核细胞可为没有被转染编码具有促神经发生 功能蛋白质的核酸和/或没有转染小分子RNA;所述具有促神经发生功能蛋白质为